标记免疫技术新进展 上海第二医科大学附属瑞金医院检验科 顾志冬 免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 抗原 + 抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab Ag * Ab.

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2 标记免疫技术新进展 上海第二医科大学附属瑞金医院检验科 顾志冬

3 免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 抗原 + 抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab Ag * Ab

4 分析物 抗体 其他物质 抗原抗体复合物 免疫沉淀反应

5 + 颗粒加强免疫浊度分析 抗原 抗体包 被颗粒 抗原抗体复合物

6 标记免疫方法 & Berson 1959 Yalow & Berson 放免 1971 Engvall 酶联免疫吸附 1982 Neurman 时间分辨荧光 1991 Blackburn 电化学发光

7 标记免疫的分类 按标记物不同分类： 放射性核素标记免疫 酶标记免疫 荧光标记免疫 化学发光标记免疫

8 标记免疫的分类 按反应系统的物理状态分类： 均相标记免疫分析 非均相标记免疫分析

9 非均相标记免疫的分离方法 1. 双抗体法 2. 包被试管或板法 3. 颗粒固相分离法 4. 吸附法 5. 溶剂或盐析法 6. 磁性颗粒分离法

10 P.A. Bonini et al. “Immunoassay systems” 标记物类型标记物名称 可达到的检测限（ /L ） 放射性同位素 3 H5x10- 15 mole 125 I5x10 -17 mole 酶 Beta-galactosidase1.5x10 -16 mole Horseradish peroxidase3x10 -16 mole Alkaline phosphatase5x10 -17 mole 生物发光 Firefly luciferin/luciferase5.6 x 10 -16 photons/min/mg Enzyme enhanced10 -19 mole Firefly luciferin/luciferase10 -19 mole 荧光 Europium(III) ion2x10 -17 mole Fluorescein10 -13 mole 酶 /chemiluminescencePeroxidase/luminol/enhancer<10 -15 mole Glucose-6-phosphate dehydrogenase peoxidase/10 -18 mole isoluminol * AMPPD10 -21 mole 各种方法学灵敏度对比

11 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/mL ng/mL  g/mL mg/mL g/L 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins

12 放射免疫的创立 1959 美国 Yalow & Berson 1960 英国 Ekim ’ s 1977 获诺贝尔医学生物学奖 医学生物学超微量分析的里程碑

13 放射免疫的精髓 R ：放射性核素示踪 高灵敏 不直接探测待测物，而探测待测物 上的标记信号 ( 标记物的放大效应 ) I ：免疫学反应 高特异 废除以往沿用的无机或有机试剂，代 之以抗体为结合剂

14 放射免疫面临的挑战 半衰期短，限制了药盒使用寿命 由于标记物的不断变化，带来药盒批间、批内较大的差 异，标准曲线无法保存备用 反应时间过长 ( 数小时至过夜 ) 结果测量依靠时间累计，至少每一样品一分钟 其主要的缺陷是： 理论和实践证明其分析的限度是 10 -7 分子 /mL 或 10 -12 g/mL ，要再提高有困难 以上原因都造成放射免疫无法进行自动化分析

15 新技术的挑战 放免其必然受到一代新的更灵敏、稳定、快速，而且 全自动化的测量技术的挑战。酶免以其更高的灵敏度、 对环境的无害、仪器的自动化及检测的方便性、试剂 的稳定性、标记的多样扩大性等优点正逐步取代放免 的主导地位。 从 90 年代开始放免分析在国际上每年以 10~15% 的速 度下降，这是事实。一些大型的实验室，标本量大的 项目都已逐步应用各种非放免标记的自动化设备来进 行分析，这是技术发展的必然规律。

16 酶免疫分析 酶与底物 1. 辣根过氧化物酶 过氧化氢和还 原型氢供体 2. 碱性磷酸酶 对位硝基酚磷酸酯、 二氧乙烷（ dioxetane) 3.β-D- 半乳糖苷酶 邻位硝基酚半 乳糖吡喃苷

17 三种酶的比较 酶类 相对价格 /mg 相对分子量 相对偶联率 相对成本 相对可检测值 呈色 荧光 POase 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Apase 34.24 1.92 0.1 650 4002.00 Bgase 25.8210.57 1.33 200 400.04

18 酶免疫分析的放大技术 1. 生物素 - 亲和素系统 2. 荧光酶免疫分析 3. 增强化学发光酶免疫技术

19 荧光免疫技术 1. 荧光偏振光免疫技术 2. 时间分辨荧光免疫技术

20 使用 MEIA ， ICIA 的仪器 Abbott - IMx, AxSYM

21 时间分辨荧光

22 化学发光标记免疫技术

23 使用 AMPPD 为底物的仪器 Beckman-Coulter Access DPC Immulite, Immulite 2000 Biotrol Magia 120

24 直接化学发光特点 反应速度快 发光持续时间过短，衰减很快 信号强度不高，易受环境物质的干扰 本底较高，信噪比较小

25 酶促化学发光特点 发光持续时间明显延长 明显增强信号和信噪比 明显提高灵敏度 简化操作和测量

26 电化学发光特点 特异性发光，完全无本底 检测线形宽 标记物循环利用，发光时间长

27 标记免疫的自动化进程 全自动化的含义 1. 自动完成检测过程 2. 自动对仪器各项功能指标监测 3. 随机进样 4. 急诊优先功能 5.LIS 系统的链接

28 自动标记免疫分析的优点 消除手工操作的误差 灵敏度高，稳定性好 速度快、当天报告 特殊项目的测定 实现短时间反馈 (Short Turn-around Time) 提高临床诊断效率和质量，有效降低总医疗费用

29 放免标记的自动化 全自动放免分析仪尚未出现, 但 10 孔或 20 孔放免仪正逐步替代 单管链轨式的放免仪

30 酶标记技术的自动化进程 1. 自动板式酶标仪 2. 自动管式酶标仪 3. 全自动珠式酶标仪

31 化学发光标记免疫的自动化 主流产品： 1.ACCESS 2.ACS-180 3.ECL1010 、 2010

32 化学发光标记自动检测过程 混匀 超声波、搅拌器、震荡 取样 金属针、一次性 TIP 头 孵育 孵育板、孵育带 分离 磁性颗粒分离 检测 流动比色池、单管比色

33 ACCESS 全自动微粒子化学发光免疫系统

34 O- O O OCH3 OPO3Na2 O O OCH3 O- O OCH3* 发光 Alkaline Phosphatase 发光底物在碱性磷酸酶作用下磷酸酯基发生水解， 脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体 AMPD - ， ( 半衰期 2~30 分钟 ) 。此中间体分子内电子 转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态 的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生 470nm 的光，并可持续几十分钟。 AMPPD 反应原理 --Access 非直接免疫化学发光

35 AMPPD 特性 碱性 PH 环境下，非酶解性的水解很低 热稳定性好 PH9 时酶解速度最快， PH9.5 时信噪比 最低 发光为持续型， 15min 达到高峰， 60min 内强度维持不变

36 相对 发光 单位 00 5 10 55 60 时间（分钟） 发光图谱连续，稳定。 允许多次 记数，取均值作为结果。 AMPPD 发光图谱

37 加入 标本, 磁性微粒子， 试剂 孵育 促进抗原 抗体结合 洗涤，磁 性分离， 去除未结 合成分 加入发光 底物，产 生信号 孵育，促使 信号产生 检测信号 ACCESS 分析简要流程

38 ACCESS 专利，独有技术 磁性微粒子技术： d<7  超声波清洗系统：交叉污染率 <1ppm 多层覆膜试剂盒：确保稳定性 12-18 个月 机上自备试剂冷藏系统：试剂保存于三度 磁性清洗分离技术：保证高灵敏度 随机加入消耗品

39 与包被管或包被珠相比反应表 面积增大 50 倍，增加了抗体的 用量，并因分散悬浮于液体 ( 称为类均相 ) ，大大加快了速 度。 又因为是可磁化颗粒，便于自 动化和提高 B/F 分离效率，降 低了本底，提高了灵敏度。

40 试剂容量 24 个试剂位 自封闭，多层覆膜试剂盒 机上试剂冷藏装置 试剂保质期长 系统性能

41 ACS:180 SE 全自动化学发光免疫系统

42 ACS:180 SE 独特的优势 直接标记的化学发光 - 快速 强烈的直接发光在一秒内完成。 ACS 分析仪的光度计在整 个发光的前, 中, 后过程中进行 500 次连续读数。所以出第一 个结果的时间很快并可获快速急诊报告。 吖啶酯的发光反应 简单, 直接, 快速。 在一秒钟内光子散 射已达到高峰，而 整个过程亦只在两 秒钟內完成 吖啶酯的发光反应 简单, 直接, 快速。 在一秒钟内光子散 射已达到高峰，而 整个过程亦只在两 秒钟內完成。

43 吖啶酯的直接发光对酸碱度和溫度的变化相对並不敏感， 保证了良好的仪器工作性能。 ACS:180 SE

44 使用电化学发光技术的仪器 Roche Elecsys 1010, 2010

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47 三种仪器主要性能比较 ACCESS ACS-180 ECL1010 、 2010 原理 酶扩大化学发光 直接化学发光 电化学发光 灵敏度 10 -21 10 -16 10 -18 测试速度 100tests/H 180tests/H 92tests/H 仪器价格 中 低 高 试剂价格 中 低 高 市场占有量 250 台 >300 台 150 台 开展项目 42 25 38 连续检测数 600 260 300 消耗品随机更换 可 不可 不可 试剂稳定性 >1 年 3 个月 >1 年 试剂定货周期 1 周 1 月以上 3 月以上 试剂上机保存时间 到效期 8H 4 周 性能价格比 高 低 中

48 高特异 经典免疫学原理，单克隆抗体技术 大分子采用夹心法分析 小分子采用竞争法分析 专利的磁性分离技术 ACCESS 系统特点

49 高灵敏 采用最灵敏、最稳定的 ALP-Dioxetane 放大系统 采用最持久最稳定的发光剂 AMPPD 采用磁性微粒子技术 (d<7 µ ) 扩大包被面积 以 TSH 为例， 检测限达 0.003 µ IU/ml ，为第三代 TSH ACCESS 系统特点

50 高稳定 发光信号稳定，持续 高质量原厂试剂, 无需预处理 稳定，持久的标准曲线，有效期长达 28 天以上 机上试剂冷藏系统，试剂 3 度保存，有效期长 多层覆膜试剂盒，确保试剂稳定 ACCESS 系统特点

51 高准确 超灵敏光电倍增管检测发光信号 发光稳定后，记录 10 次 /s ，取均值为结果 超声波清洗系统，严格防止交叉污染 (<1ppm) 系统自动 QC 管理 (Levy-Jennings) ACCESS 系统特点

52 全自动，连续，任选，随机式 检测速度 100 测试 / 小时，第一个结果需 15 分钟 利用条码连续加入标本，一次上机 60 个，运行中 利用条码连续加入试剂，一次上机 24 个，运行中 不停机加入各种耗品，耗品预警功能 24 小时待机，确保急诊检测 HCG; Myoglobin; Troponin 计算机控制，形象化软件， Host Query 功能

53 ACCESS 试剂项目 心血管动力学 Accu TnI 糖尿病 甲状腺激素 第三代 TSH 血液病毒 内分泌系统 性激素 感染性疾病 贫血 肿瘤因子 游离 PSA 过敏原 代谢疾病 治疗药物监测

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55 w PSA 的两种主要形式 游离 PSA 结合 PSA (PSA-ACT)  -1-antichymotrypsin 抗原结合部位 PSA ACT

56 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 良性疾病的 可能性增加 前列腺癌的 可能性增加 FREE PSA % 结果解释

57 ACCESS 筛查唐氏综合症 唐氏综合症是一种因常染色体 21 多了一条 ( 完全型 三体、易位型三体或嵌合型三体 ) 而引起的一种先天性 疾病

58 唐氏症的寿命 智力、生长、发育；内脏、外貌多方面的 异常 50% 的患儿在 5 岁前死亡 8% 活过 40 岁 仅 2.6% 活过 50 岁 患者平均寿命仅为 16.2 岁

59 为什么要筛查唐氏症？ 唐氏症患儿不仅体貌异常、智力低下，而且 疾病繁多、寿命短暂。除患者自身痛苦外， 给家庭和社会带来极大的精神和经济负担。 目前还无法预防，更无法治疗，唯一有效的 方法是进行产前筛查，明确诊断后，终止妊 娠，防止唐氏儿的出生。 唐氏症的产前筛查不仅是一个医学问 题，也是一个社会问题；不仅有助于 家庭，也有助于国家。

60 常见新生儿先天疾病 1:3800 1:58000 1:10000 1:700

61 哪些孕妇需进行产前筛查 大于 35 岁后，唐氏症的出生率明显 增高，但总出生量只占不到 30% ，其 余 70% 多均为 34 岁以下的孕妇所生 应该对所有孕妇进行筛查

62 筛查的概念 从一个带有未知危险度的群体中，区分出那些 具有足够危险度的个体，并进行下一步的诊断 检测和治疗 筛查对象 --- 每个孕妇 --- 缺乏症状和信号的情况下 筛查作用 --- 筛检出高危人群

63 筛查程序的优点 --- 非侵入性检测 --- 不需羊水穿刺 --- 简便可行 --- 对 35 岁以上的孕妇提供信心 --- 对 35 岁以下的孕妇进行危险预测 --- 增加患者的选择

64 * 完全孕周 e.g. 14 = 14+0 to 14+6 days 贝克曼库尔特公司 ACCESS 加权回归中位值

65 初始风险度 ( 年龄特异性危险度 ) × LR(AFP) × LR(HCG) × LR(uE3) = 总风险度 总风险度 ( 合并危险度 ) 计算

66 妊娠 15-20 周时抽血 5mL 测定 AFP ， HCG ， uE3 将孕妇的 基本资料 填写在申 请单上 OSB 危险度 >1:1152 电脑算出唐氏症 的合并危险度 怀疑 NTD 做胎儿 超声波检查 唐氏症儿筛查流程图 待续

67 唐氏症危险度 >1/270 唐氏症危险度 <1/270 以超声波确认孕周 发阴性报告并追踪妊娠 结果及由新生儿科医师 来确认婴儿是否正常 不符合符合 发阳性报告并建议 孕妇羊水穿刺，细 胞染色体检查 修订周数重新计算， 若周数不足 15 周则待 15 周时再行检测母血 重新计算 正常异常 追踪妊娠结果由新 生儿科医师来确认 婴儿是否正常 遗传咨询及 进一步处理

68 谢谢！