一氧化氮与心血管疾病.

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1 一氧化氮与心血管疾病

2 内 容 一氧化氮（NO,nitric oxide）发现与证实 NO的合成与释放 NO的作用与机制 NOS（NO synthase）分布与分类
内 容 一氧化氮（NO,nitric oxide）发现与证实 NO的合成与释放 NO的作用与机制 NOS（NO synthase）分布与分类 NO心血管生理学作用 NO在心血管疾病中的作用 NO供体 NOS抑制剂

3 NO的发现 1980年，Furchgott等报道Ach、缓激肽和ATP等引起的血管舒张依赖于血管内皮的存在，并是由一种不稳定的体液介质（EDRF）介导。 1986年：Furchgott和美国的Ignarro同时提出EDRF就是NO。 1988年：Palmer证实L-精氨酸（L-Arg）为NO生成的前体，R-Arg的导构体（R-Arg）可以抑制NO的合成。 1998年：Furchgott、Ignarro和 Murad荣获Nobel生理学和医学奖。

4 NO生理作用的认识首先要归功于微量分析技术
NO在生命体内的浓度极低,仅为μmol/L级甚至更低,而且ＮＯ在体内的存留时间很短,半衰期仅为6ｓ,因此发现它、检测它非常困难。 为了全面揭示NO在生命过程中的作用,如何实现NO的实时在体连续检测是一个关键的问题。因为NO只有在体内才能显示正常的生理作用,离体分析已经不能满足生命科学研究的要求,因此将微型传感器直接插入体内进行在体实时检测,才是研究生命体内分子作用机理的最有效的方法。 目前检测体内ＮＯ最有效的方法是电分析方法。电化学方法测量NO有许多独特的优点： 第一,使用的微电极直径可以小至2～6μｍ; 第二,该方法有极高的灵敏度和很强的抗干扰能力,其检测限低至10-9mol/μｍ， 第三,该方法的响应时间小于10ｍｓ.分析化学工作者对ＮＯ实时在体检测方法的不断完善,必将有力地促进对NO生理作用的研究

5 EDRF和NO比较： 都能引起血管条短暂舒张； 减少血小板粘附，抑制血小板聚集并使聚集的血小板解聚； 半衰期都很短； 作用都可被血红蛋白和亚甲蓝所抑制； 都是通过激活鸟苷酸环化酶使细胞内cGMP含量增加而发挥作用。 用化学方法测定NO，证明缓激肽可引起NO释放。

6 NO的生物学特性 化学性质活泼：其T1/2仅2-5sec； 易与氧反应，生成新的毒性自由基
可被O2-灭活而生成过氧化亚硝酸阴离子(ONOO-)。 在酸性条件下： ONOO-   氧化性及对细胞的毒性作用均明显强于NO。

7 NO 细胞内的合成 L-Arg，L-OH-Arg和含精氨酸的小分子多肽是合成NO的前体。
在组织中，L-Arg以还原型辅酶II（NADPH）作为电子供体。 生成的NO以扩散的形式到达并进入靶细胞。

8 NO合成和释放的影响因素 引起NO合成和释放的刺激主要有两种： 化学性刺激（如Ach、缓激肽等）；
机械性刺激（如血管张力、剪应力、EC变形及血液脉冲流动等）： 剪应力加大可激活位于EC表面的机械性感受器，使NOS活性增强。 *NO及NO前体可以反馈性抑制主动脉EC中的NOS，而不影响NO对VSM的直接舒张作用

9 NO作用机制 NO弥散进入VSM细胞内，通过与鸟苷酸环化酶(GC)中血红素卟啉环中的Fe2+结合，将卟啉环中的Fe2+ 拉出表面，引起GC构型发生改变而激活，从而使三磷酸鸟苷（GTP）转变为环磷酸鸟苷（cGMP），导致细胞内cGMP水平升高。 cGMP水平升高 —调节离子通道 —依赖于cGMP的蛋白激酶 —激活cGMP的磷酸二酯酶 —抑制cGMP的磷酸二酯酶

10 NO的细胞毒性 病理状态下，NO短暂升高，一方面，它对人体可起到有益作用（抗菌、抗寄生虫、抗病毒或杀伤肿瘤）；另一方面，不加控制的高水平NO则对人体有害： —ONOO-   —与一些酶的铁-硫中心结合，影响线粒体电子传递、柠檬酸循环和DNA合成。

11 NOS分类及分布 应用蛋白质生化和分子克隆技术已分离出至少3种独立的NOS基因，并以组成或克隆的先后顺序命名为：
①神经型（ncNOS）或称I型NOS：脑、平滑肌、骨骼肌、肝细胞以及胰、胃、肾等 ②巨噬细胞型（iNOS）又称免疫型或II型NOS：巨噬细胞、肥大细胞、神经胶质细胞、单核细胞、内皮细胞以及心肌细胞 ③内皮型（ecNOS）或III型NOS：血管内皮细胞

12 NOS在细胞内存在形式 NOS是一种含铁的单胺氧化酶，根据对Ca2+的依赖性，在细胞内的存在形式分为：
结构型NOS(cNOS)：活性受Ca2+和CaM浓度的调控；主要分布于血管内皮细胞、血小板，神经组织中次之。 诱导型NOS (iNOS)：活性与Ca2+浓度无关，但需要脂多糖（LPS）和细胞因子如IL-1和IFN-激活后才能表达。也可被塞米松、皮质类固醇、雌激素、生长转化因子、IL-4、IL-8及IL-10所抑制。

13 NO的生理病理作用 神经系统作用 与经典的神经介质不同，NO在神经元之间或神经元与胶质细胞之间进行顺向和逆向的信息传递。它在心脑血管，神经系统和免疫系统有很广泛的功能。已经证明内皮细胞、神经元和神经纤维末稍(非肾上腺和非胆碱神经纤维，NANC)以及神经胶质细胞内均有NO合酶(NOS)。 现已克隆出3种重要的NOS(nNOS,eNOS和iNOS)，在脑和内皮细胞中的NOS很相似，差别在于脑内的nNOS存在于细胞浆内，内皮的eNOS则与细胞膜相结合。从功能上NOS可分为原生型NOS(constitutive nOS,cNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)两类，前者包括nNOS和eNOS。

14 NO在脑循环和脑损伤过程中起重要作用 对脑循环作用：NO是很强的血管扩张剂，抑制血小板聚集和白细胞粘连。在生理状态下，由内皮、神经元和胶质细胞生成的NO作用于平滑肌细胞内的乌苷酸环化酶，生成cGMP，引起脑血管扩张，脑血流(CBF)增加。生成的NO还可通过负反馈限制NO的生成。持续的NO生成，使脑血管保持正常张力

15 传递神经信息 近年发现NO是一种新的神经递质，扮演着信使分子的作用,其作用方式不同于经典的信息传递模式。人类长期记忆和学习能力的获得，有赖于加强前后突触细胞间的联系，当后突触反复受到刺激时会产生越来越强的响应，长期记忆便可形成。在这一过程中,有一种被称为“逆行信使”的物质从后突触通过突触隙到达前突触促使其释放递质，从而使后突触得到反复刺激.现在认为,这一神秘的“逆行信使”正是NO。 研究人员将NO抑制剂注入小白鼠的大脑中，结果发现它们失去了记忆,再也走不出水迷宫。但机体内的NO浓度水平有二重性，过量的NO会引起不良后果，大脑中NO过量则会引起脑损伤。

16 老年痴呆至少可分为三种，即老年性痴呆、血管性痴呆（VD）和混合性痴呆
遗传因素 　　AD具有家族聚集性，约20％的患者有阳性家族史。分子生物学研究证明，第21、19、14和1号染色体上有异常基因位点，这些受累基因所编码的蛋白质分别为：β淀粉样蛋白（β—AP）、载脂蛋白E（ApoE）、早酪蛋白-1（PS-1）和早老蛋白-2（PS-2）。这些基因的突变和多肽性改变与AD发病有关。β-AP是由β—淀粉样前体蛋白（β-APP）异常裂解而生成的，是老年斑形成的主要成分。Apo E基因是影响老化途径最重要的遗传学因素之一。 神经递质学说 　　与AD相关的递质改变有乙酰胆碱系统、单胺系统、氨基酸类和神经肽递质，其中胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱类递质的减少是AD的重要原因。AD患者有大脑皮质和海马部位乙酰胆碱转移酶活性降低，直接影响了乙酰胆碱的合成和胆碱能系统的功能。此外，AD无患者生长抑素、促肾上腺皮质释放因子及去甲肾上腺素均明显减少，多巴胺羟化酶活性均显著降低。 病毒感染 　　实验证明，使羊脑组织变形的病毒接种于小白鼠脑内可出现典型的老年斑。体外实验显示，疱疹病毒感染能使嗜铬细胞PC12 细胞乙酰胆碱转移酶水平降低。提示病毒感染可能是本病的原因之一。 金属作用 　　部分AD患者脑内铝浓度可达正常脑的10—30倍，老年斑（SP）核心中有铝沉积、偷袭致痴呆时亦可见脑铝增多，因此，推测铝与痴呆有关。 免疫功能紊乱，自由基损伤 　　免疫功能紊乱，自由基损伤等均有与AD的发病有关。AD的脑反应性抗体比对照组高20％，说明本病患者的自身抗体含量增加，可能对神经元的消失和衰老起作用。

17 一氧化氮（NO）在中枢神经系统中起信使和递质样作用，适量的NO对神经元具有保护作用，NOS阳性神经元能抵御某些神经毒素的毒害，但脑内NO的过量释放对其周围神经元又有毒性作用。观察生成的NO的专一合成酶NOS，可间接了解NO在组织中的分布。 建立大鼠血管性痴呆模型后研究发现，VD组大鼠在饲养四周后海马内NOS阳性神经元表达明显减少，分析可能与缺血早期NOS大量表达产生具有神经毒性作用的NO有关。

18 免疫调节 当生物体受到外界物质入侵时,体内各器官和组织中的巨噬细胞会被激活,吞噬入侵物质(吞噬作用),这就是免疫反应。此外巨噬细胞还可以不通过吞噬作用而直接杀死微生物,这一过程就与NO有关。 人们早就知道免疫系统的活动与尿中硝酸盐含量升高有关,显然NO是硝酸盐的前体。 据报道, NO作为机体的免疫系统的一部分,至少有两种作用方式,一是依靠自身的毒性直接杀死细菌;二是阻断细菌的代谢途径。在后一种方式中, NO攻击某些酶中的金属离子,导致酶畸变,病毒细胞无法分裂和生长。 NO在巨噬细胞中的受控生成,是巨噬细胞杀死癌症细胞和入侵微生物的重要原因。

19 生殖系统作用 调节性功能 NO与男性的性生理过程有直接的关系.当生殖器神经得到性兴奋的信息后即产生NO,引起生殖器血管扩张,血液涌入而完成勃起.若NO的生成出现障碍,所有重要的血管不能扩张就会导致勃起障碍.  雌激素的作用 绝经前妇女心血管疾病的发病率和死亡率均低于男性，但绝经后迅速上升，达到与男性相似。目前认为绝经前，雌激素可能对动脉粥样硬化和心肌梗死有预防作用，其机制尚不完全清楚，已发现心血管系统有雌激素受体，雌激素可能刺激高密度脂蛋白的生成，减少低密度脂蛋白，因而可降低血中胆固醇。雌激素能使血管内皮细胞产生NO，使血管扩张，改善循环。血管上皮细胞有雌激素受体，雌激素对钙有拮抗作用，可能抑制动脉粥样硬化和斑块的生成。

20 癌症 在多种肿瘤病人体内检测到NO水平增加。 ＮＯ可能参与了肿瘤发生发展过程，而晚期肿瘤患者血ＮＯ下降趋势有可能成为预后不良的临床指标
一氧化氮（ＮＯ）参与了体内的多种病理生理过程，由于ＮＯ合酶（ＮＯＳ）广泛存在于各种肿瘤细胞中〔１〕，ＮＯ与肿瘤发生发展的关系已日益受到关注。 自由基是一类化学性质活跃的物质，它可使生物膜脂质过氧化，蛋白质变性、细胞坏死， 甚至基因突变，引发肿瘤。

21 NO在心血管中的生物学作用 （一）舒张血管，降低血压 —短期机制： a.NO作用机制； b. 减少血管对非肾上腺素能刺激的反应。
—长期机制：通过调节内皮血管收缩和生长因子的表达。 *正常生理情况下，它改变血 管的基础张力， 调节血压和组织血流量。血液中的乙酰胆碱(ACh)、缓激肽，以及血小板释放的5-羟色胺、 凝血酶原、ADP等活性物质均是通过L-arg-NO途径而发挥扩血管作用的。

22 NO作用机制： NO弥散进入VSM细胞内，激活鸟苷酸环化酶，从而使三磷酸鸟苷转变为环磷酸鸟苷。使得肌球蛋白去磷酸化，进而使VSM松驰，血管扩张血压下降。

23 （二）维持心输出量 负性肌力和降低心肌氧耗量 *内源性或外源性NO对离体豚鼠心脏 *用L-NAME动脉注射 对心肌收缩力和氧耗量无明显影响 *麻醉犬：L-NAME，可使体循环阻力增加和剂量依赖性的血压升高。 参与冠脉收缩与舒张的动态平衡，使动脉始终维持较低张力，对冠脉基础血流量无影响。

24 （三）抑制血小板粘附聚集，参与内皮抗血栓作用
有效的血小板抑制剂 *可抑制由ADP诱导的血小板聚集 *血小板中含有NOS，其活性随血小板激活而增加。 与前列环素抗血小板聚集有协同作用 内皮表面的抗血栓作用取决于两者作用的协同。 使血小板中甘油醛3‘磷酸脱氢酶发生ADP核糖基化。

25 （四）抑制能量代谢 NO通过3种不同途径抑制ATP的产生： —通过转移ATP-核糖到3-磷酸甘油醛脱氢酶阻止葡萄糖分解； —通过结合到顺式-乌头酸酶的血红素基团阻断三羧酸循环； —结合到辅酶Q还原酶的血红素基团而抑制氧化磷酸化。

26 NO病理生理作用 （一）败血症休克—低血压
机制：G-释放的内毒素可以触发MФ和T淋巴细胞炎性细胞因子引起败血症休克和释放IL-1、IL-2、TXA2、IFN-和TNF-、，诱导MФ和VSMCs的iNOS过度表达，导致NO过量生成，引起血管扩张和组织的损伤。 NOS抑制剂：可以逆转内毒素诱导的低血压，同时可改善临床上难治性低血压。

27 （二）与心肌收缩功能不足的关系 心力衰竭时，NO可能通过下列途径增加释放： —TNF- 、IL-2和IL-6通过激活cNOS，使NOS mRNA在心肌细胞表达增多； —炎性细胞因子可使心肌细胞iNOS活性明显提高，这可能是心衰患者心肌收缩功能不全的原因； 心衰时NO代偿性增多： —可减弱肾上腺素能受体激活产生的正性肌力作用，而CHF患者此受体敏感性下降。 —NO可对抗内皮素、血管紧张素等的血管收缩作用而降低外周阻力；负性肌力可使心肌收缩减弱，耗氧降低 —释放过量，具有细胞毒性作用，可影响组织细胞的能量代谢等。

28 （三）心肌缺血再灌注损伤（I/R, ischemia/reperfusion）
再灌注期间，激活的白细胞和MФ渗入到心肌缺血区，释放出炎症介质和细胞因子，激活心肌iNOS，导致过量NO生成，进而加重心肌损伤。 I/R可引起细胞凋亡。其严重程度与iNOS活性增高相一致。先用S-甲基异硫脲硫酸盐抑制iNOS可明显增加局部心肌血流和改善左室功能。因此推测iNOS生成增多可能是心肌细胞凋亡的机制之一。 IV SOD，可减少ONOO-和OH的形成，减轻内皮功能障碍和改善动脉压，保护心肌功能。 适量的NO抑制中性白细胞吸附和浸润到血管壁和心肌组织。NO前体SPM-5186能减轻兔I/R模型中心肌坏死和白细胞的集聚。从而减轻炎症反应。

29 （四）与动脉粥样硬化的关系 内皮基础水平的NO通过抑制血小板粘附聚集、血栓形成和减少血管通透性，抑制AS形成； HC导致内皮功能受损，减少基础和药理刺激引起的内皮NO释放，导致NO抗AS功能减弱； 白细胞粘附是AS 的早期因素。NO通过影响白细胞粘附分子CD11、CD1 8的活性或抑 制其表达，从而抑制白细胞粘附于血管内皮。 NO很可能通过cGMP诱导机制，抑制SMC的分裂和增殖，通过抑制其增殖减少其胶原纤维、弹力纤维的产生，进一步防止动脉粥样斑块和硬化的形成和发展。 L-arg能恢复HC损伤的内皮功能，提高血管对硝基扩血管物质的敏感性。

30 （五）冠状动脉痉挛（CAS） NO作为一种重要的心血管调节因子，有很强的扩张血管作用。eNOS的正常结构和功能是维持冠状动脉正常舒缩状态、防止CAS的重要条件。 CAS患者存在eNOS基因的缺失或突变，导致eNOS基因的表达减少，而使冠状动脉局部eNOS的活性及含量下降，使NO合成减少，以致血管活性物质平衡失调，促进CAS的发生

31 （六）高血压 原发性高血压患者内皮功能缺陷：基础NO释放减少，内皮依赖性血管舒张缺陷。 NO分泌减少： —ET和NO之间的平衡破坏，血管收缩，周围血管阻力增加; —促使VSMC的有丝分裂，VSMC增殖并向内膜下迁移，使血管腔狭窄，管壁增厚; —促使血小板粘附和聚集，血液粘滞性增高，加重微循环障碍，增加外周阻力， SHR：给予NOS竞争性拮抗剂L-NNA( N-硝基-L-精氨酸)后，血压进一步升高，脑卒中发生率显著增加。导致血压升高

32 NO供体研究进展（NO donor） 正常生理状态下机体可产生适当水平的NO以维持各系统的机能，但许多慢性疾病如高血压、动脉粥样硬化等可造成血管内皮细胞损伤，使NO产生减少，此时补充外源性NO是一种必要的治疗措施 NO供体是一类能在体内释放出NO的前体药物，通常是指亚硝基类血管舒张剂，包括无机亚硝酸盐（如硝普钠）、有机硝酸(亚硝酸)盐（如硝酸甘油）和巯亚硝基硫醇（如巯亚硝基谷光甘肽）等，有人将NO生物合成过程中的L-arg也归为NO供体。

33 L-精氨酸（L-arg） 在体实验证明L-arg可抑制血小板聚集和粘附，并能对抗高胆固醇引起的大鼠前列腺组织松弛缺陷，提示L-arg对栓塞性疾病具有一定疗效。 L-arg可松弛离体血管平滑肌，对冠状动脉血管的作用尤为明显；临床资料证明L-arg对轻度高血压和肺动脉高压患者有降压作用。 在大鼠缺血再灌注模型实验中，动物预先给予L-arg，可改善肾功能、增加尿量、降低尿肌苷水平，但同时使肾脏丙二醛的含量增加。

34 硝普钠（SNP） 临床用做降压药和氰化物中毒的解毒剂
降压机制是通过释放NO，激活鸟苷酸环化酶，增加血管平滑肌细胞内cGMP水平，从而扩张血管； SNP可抑制由ADP和胶原蛋白诱导的血小板聚集，与其他NO供体不同的是SNP的这一作用不具有cGMP依赖性； SNP可增强介导葡萄糖摄取的5’AMP蛋白激酶α催化亚基的活性。

35 硝酸酯类（nitrate esters） 包括硝酸甘油、戊四硝酯、硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯等，均为临床常用的抗心绞痛药物 血管平滑肌内释放NO，NO与相应受体结合，促进cGMP的合成，同时抑制细胞Ca2+内流，降低细胞膜K+通道的活性，从而使血管平滑肌松弛而产生抗心绞痛作用 GTN起效迅速，并具有促进脑部血液循环的作用，但对血小板聚集的抑制作用不强。 尼可地尔（nicorandil）又名硝烟酯，是一新型血管扩张药。在体内通过释放NO、增加细胞内cGMP生成和激活钾通道，而扩张冠状动脉血管。

36 亚硝胺类(nitrosoamine)  为含硝基或亚硝基的胺类化合物，在体内产生NO。
吗多明已使用于临床治疗稳定型心绞痛、充盈压较高的急性心肌梗死。其作用机制是扩张容量血管、降低心脏前负荷、扩张阻力血管而降低心脏后负荷，从而降低心肌耗氧量；也能扩张冠状动脉，促进侧枝循环开放，增加缺血区的血液供应。 SIN-1具有较强抑制冠状动脉血栓形成和较明显降压作用。可对抗β-肾上腺神经递质对大鼠心肌细胞的正性肌力作用，降低心肌细胞收缩幅度和瞬时Ca2+浓度。其机制与降低细胞内cAMP水平，升高cGMP水平，抑制受磷蛋白及肌钙蛋白I的磷酸化有关。

37 亚硝基硫醇类（nitrosothiols）
由某些化合物上的巯基（-SH）H原子被亚硝基取代后所形成。亚硝基硫醇类化合物在体内可被迅速分解释放出NO。 而起到松弛血管平滑肌，降低血压的效果。具有降低血压和抑制血小板聚集的作用。 可用于预防动脉粥样硬化和缺血再灌注损伤等疾病的治疗。

38 NO-非甾体抗炎药（NO-NSAIDS）
美国：I/IIa 临床实验结果证实，NCX 4016具有独特的心血管抗炎症谱，安全性良好。用LPS注射诱导血管炎症，血小板和凝血活性的人临床模型。I期实验表明重复给药一个星期后剂量加至800mg一天两次治疗，内窥镜治疗发现安全性非常好。它是阿斯匹林NO供体衍生物，主要用于心血管病的预防和治疗。

39 NOS抑制剂研究进展 左旋精氨酸(L-arg)类似物：如 L-NMA, L-NCPA，L-NAA, L-NAHA, L-NAME, L-NMME等都是NOS的竞争性抑制剂。 其中L-NAME和L-NAA是iNOS的选择性抑制剂，对白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生的心肌收缩能力衰退具有明显的保护作用。

40 糖皮质激素： —能抑制各种细胞中由内毒素或细胞因子诱导的NOS的活性，包括内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肝细胞等。 —能显著地抑制心肌梗塞中iNOS的表达和转录，降低心肌细胞中cGMP水平，降低过量NO对心肌细胞的毒性作用，对心肌的收缩功能起代偿作用。 —对cNOS无抑制作用。

41 氨基胍 (aminoguanidine) 是一种iNOS的选择性抑制剂，抑制作用大于精氨酸类似物， 它对iNOS的抑制作用明显大于cNOS。 它能明显延缓内毒素休克引起的循环衰竭，改善内毒素血症中老鼠的成活率； 通过抑制iNOS的活性，使NO的合成减少，抑制内毒素血症引起的血压下降和对去甲肾上腺素的血管低反应性

42 异硫脲类似物（被硫替代的）：如 硫-甲基异硫脲(SMT)、硫-氨乙基异硫脲(SAETU)、硫-乙基异硫脲(SETU)、硫-异丙基异硫脲( SIPTU) 都是NOS抑制剂。 前两者是iNOS的强大抑制剂。抑制作用明显>L-NMA，但对血管内皮细胞NOS的抑制作用L-NMA 显著地改善急性心肌梗塞后的左室功能，增加心肌的血流供应。

43 其它NOS抑制剂 双氢吡啶拮抗剂和钙通道激动剂(BYk8644)是一种非钙依赖性NOS抑制剂。能抑制内毒素诱导巨噬细胞产生NOS。钙拮抗剂硝苯吡啶同样能够抑制体内和体外非钙依赖性NOS的活性。 转移生长因子-β2剂量依赖性地抑制白介素-1β和TNF-α刺激GC的形成和NOS的诱导。 亚甲蓝，一种GC抑制剂，它同样抑制NOS的活性，改善脓毒性休克的血流动力学。 环胞霉素，一种免疫抑制剂，可有效地抑制iNOS基因和iNOS酶活性。