第三章 培养液的组成和制备.

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1 第三章 培养液的组成和制备

2 教学目的和要求 掌握培养液的基本成分、血清细胞培养液 掌握平衡盐溶液的组成、作用

3 内容 培养液的基本成分 平衡盐溶液 天然培养基 合成培养基 血清细胞培养液 无血清细胞培养基 消化液 PH调整液、 L-谷氨酰胺、抗菌素液

4 一、培养液的基本成分 提供尽可能与体内生活条件相接近的培养环境，包括10个因素：
（1）温度 （2）渗透压 （3）氢离子浓度 （4）其他有机离子（5）主要的代谢物 （6）补充的代谢物 （7）激素 （8）影响细胞代谢的其他因子 （9）细胞生长的基质 （10）各因素间的相互作用。 早期：大多是完全天然成分：血清、血浆、胚胎浸出液等。接近体内状态，但组成成分复杂，未知因素比较多。 目前：人工培养液。但一般仍加5~10%血清，未知因素仍然存在，尽可能通过人工控制，减少血清等天然成分，作成低血清或无血清培养液。

5 （一）培养液的组成成分： 1、氨基酸类：只要是必需氨基酸。如：半胱氨酸、酪氨酸等。谷氨酰胺是多数细胞所需求的，提供能源和碳源。
2、维生素类：主要来自血清。 3、盐类：Na+、K+、Mg++、Ca++、Cl-、SO42 -、PO43 -、HCO3-。是调节渗透压的主要成分。 4、葡萄糖：供能，参与三羧酸循环。 5、缓冲系统：多采用磷酸盐缓冲系统。 1/15M Na2 HPO4 / KH2 PO4 Hepes（羟乙基派嗪乙硫磺酸）作为缓冲系统。 一般采用25mmol / L。如果>50mmo l / L。则对有些细胞有毒性。

6 6、矿物质类：多由血清提供。在低或无血清时，需补充Fe、Cu、 Ze、Se和稀有元素。 7、有机补充物
如：核甘酸、三羧酸循环中间产 物、丙酮酸盐、类脂化合物等。 在低血清中要加以补充。 8、激素类： 不同的激素对细胞存活与生长显示有不同效果。 如：胰岛素 促进葡萄糖、氨基酸的吸收。 生长激素 促进有丝分裂。 氢化可的松 有利于细胞粘着、细胞增殖。 9、生长因子类：主要由组织或血清提供。 如：成纤维细胞生长因子（FGF）， 表皮生长因子（EGF）。

7 （二）培养液的物理性质。 1、PH：PH7.4 最好，一般是PH6.8~7.6 酚红是常用的指示剂：
2、渗透压：人类血浆290mOsm / kg 。 一般介于260~320 mOsm / kg。 3、温度： 除了影响细胞生长外，也与PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，而影响PH值。

8 4、粘度：血清的存在，直接影响培养液粘度。 粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处理时，为尽量减少 细胞损伤，可通过提高培养液粘度来克服。 加羧甲基纤维素 或 聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度，这对低或无血清尤为重要。 5、表面张力和泡沫 表面张力有利于培养物粘着与底物上面。 在悬浮培养中，减少泡沫的产生，加防泡沫硅。

9 二、平衡盐溶液 有三个功效： 1、作为稀释、洗涤的液体，是各种人工合成培养基的基础用液。
2、提供缓冲系统，使培养液的PH维持在 培养细胞的生理范围内。 3、提供细胞代谢的水分和无机离子、能量。

10 三、天然培养基 包括体液、组织提取液。 如：血清、血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白、 胶原等。

11 （一）血清 以胎牛血清质量最好。 血清中含有： 1、多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白、酶等）和核酸。
2、多种金属离子：K+、Na+、Mg++、Cu++、Ca++等。 3、激素。 4、促贴附物质：纤粘蛋白（FN），冷析球蛋白（CIG）。 血清为细胞提供激素、生长因子、转移蛋白、基膜成分。 但血清成分个体差异大，常影响实验结果，来源又受到限制，易受污染。优质血清呈透明，淡黄色、不溶血或少溶血。 商品血清一般仅作灭菌处理，购得血清作灭活处理。 560C、30min（灭活） 保存在40C。 未灭活 保存在 - 200C。

12 （二）水解乳蛋白 为淡黄色粉末，易潮解结块。但不影响使用 乳白蛋白 蛋白酶、肽酶 水解 水解乳蛋白。 含有丰富的氨基酸。是常用的天然培养基。
乳白蛋白 蛋白酶、肽酶 水解 水解乳蛋白。 含有丰富的氨基酸。是常用的天然培养基。 使用方法： 用Hanks液配制成0.5%溶液（酸性 ），一般与合成培养基按1：1比例混合使用。

13 （三）鼠尾胶原 胶原是细胞生长的良好基质，对组织和细胞固定附着、改善生长表面的特性有很好的作用。 胶原来源：
大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛的真皮、牛眼的水晶体等。 实验室常用大鼠尾制胶原。 粘度大，难以滤过除菌，应无菌操作制备胶原。

14 （四）胚胎浸液 能促进细胞生长繁殖。 常用鸡胚、牛胚浸液。
将9~11天胎龄的鸡胚磨碎，加等量缓冲液，离心收集上清夜，即为鸡胚浸液，于-200C~-700C保存。

15 四、合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基 ，如：TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、Ham，sF12等。每种培养基都有其特定的目的。但一般都适用于多种细胞的培养。

16 1、主要成分是：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
2、合成培养基（液）的配制方法： 人工合成培养基是细胞培养基的基础培养液 “基础培养基” 因它提供细胞生存所需的营养成分。又叫 “细胞营养液”。 有干粉型、1倍工作液型、10倍浓缩型。 配制时：按说明书配制，完全溶解，并在消毒和保存中不产生沉淀 。

17 五、血清细胞培养液 完全培养基的组成 细胞生长培养基 细胞维持培养基
人工合成培养基只能维持细胞生存。要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基。常用的是血清、谷氨酰胺等。为防止污染，添加一定量的抗菌素。 基础培养基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物质后 “细胞培养基”、“完全培养基” 细胞培养基按血清含量多少又分为：（1）细胞生长培养基 （2）细胞维持培养基。 完全培养基的组成 细胞生长培养基 细胞维持培养基 基础培养基 ~90% % 血清 ~20% % 谷氨酰胺（200mmol/ L） 1 ml ml 青、链霉素 各100u / ml 各100u / ml

18 六、无血清细胞培养基 基础培养基+替代血清补充成分 （激素、生长因子、细胞附着蛋白、结合蛋白、微量元素等）
无血清培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少细胞污染，简化了提纯和鉴定McAb、淋巴因子、干扰素等细胞产物的程序，降低疫苗反应。

19 （一）基础培养基 常用的基础培养基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、IMDM、RPMI-1640等。各种培养基常以1：1混合。 补加：Hepes 15 mmol / L，Na HCO4 1.2~2.4 g / L。 缺点：培养细胞对外界刺激耐受性较差。 蒸馏水：三蒸。 最后一次蒸馏应在配制前制备后，立即使用。 （二）补充、附加成分 多数无血清培养液必须补加3~8种因子，至少要2种，已知有100多种此类因子，有些是必需补充因子， 如：胰岛素、硒酸钠、 转铁蛋白等。

20 1、激素和生长因子 2、结合蛋白 胰岛素（InS）：能调控细胞内多种代谢，加强糖原、蛋白质、 甘油三脂、DNA的合成。
其它有：生长激素、胰高血糖素等。 生长因子：表皮生长因子（EGF），神经生长因子（NGF），成纤维细胞生长因子（FGF）等。 具有促进有丝分裂、缩短细胞倍增时间的作用。 2、结合蛋白 有二种： 转铁蛋白（TF）：增强细胞摄取、利用铁的能力， 还可结合毒性金属离子。 白蛋白：与脂类、金属离子、激素等结合， 具有刺激细胞增殖作用。

21 3、贴壁因子： 帮助细胞附着贴附。主要有： （1）纤维连结素：1M的尿素PBS液配制成 1mg / ml 母液， -200C保存。
（2）多聚赖氨酸：PBS或D-Hanks液配制， 1mg / ml，4 0 C保存。 （3）胶原：PBS或0.1M盐酸或醋酸， 1~3mg / ml 。-200C保存。

22 4、微量元素 5、酶抑制剂 Se、Cd、Vit A、Vi t E 等 Se有抗氧化、增强其它因子的作用。 避免残余酶对细胞损害。
大豆胰酶抑制剂：0.1~0.5%+DMEM / F 12培养液中，滤过除菌。-200C

23 七、消化液 （一）胰蛋白酶液 （二）EDTA（乙二胺四乙酸二钠） （三）胶原蛋白酶液

24 （一）胰蛋白酶液 1、机理：除去细胞间的粘蛋白、糖蛋白。影响细胞 2、作用浓度：0.25%，0.125%。 3、最适条件：
胰蛋白酶主要来自牛、猪胰脏，黄白色粉末，易潮解。 1、机理：除去细胞间的粘蛋白、糖蛋白。影响细胞 骨架，使细胞分离。 2、作用浓度：0.25%，0.125%。 3、最适条件： 370C，PH7.4，无Ca++，Mg++，血清、蛋白质。 因这些物质能降低其活力。 所以，配制用无Ca2+，Mg2+的D-Hanks液配制酶液。 细胞一旦分散，可用血清培养液、胰酶抑制液来终止其作用。

25 （二）EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 1、机理：组织细胞的生长需要Ca++，Mg++维持 2、特点：毒性小，使用方便，价格低廉。只用于
胞分离。 2、特点：毒性小，使用方便，价格低廉。只用于 消化传代细胞。 3、作用浓度： 用无Ca++，Mg++的D-Hanks液配成 0.02%EDTA工作液，高压灭菌后使用。室温或40C保存。 EDTA和胰蛋白酶混合使用提高消化率。

26 （三）胶原蛋白酶液 1、机理： 使细胞间质的脯氨多肽水解，从而使细胞分散。 2、来源： 从芽孢杆菌中提取（溶组织梭状芽孢杆菌）
3、缺点：胶原酶中含羧菌肽酶（0.57~0.59u / mg），具有较强的 毒性，能破坏细胞膜上的蛋白质和多肽，从而导致细胞膜通透性改变。因此，用它消化组织时，应采取多步收 集法（20~30分/ 次），这样，才可获得完整细胞膜和最大活细胞收率。 4、特点：在Ca++，Mg++存在下，仍有活性，血清也 不能抑制其活性，故消化后，应充分漂洗。

27 （三）Hepes液：是一种H+缓冲剂，维持恒定PH，20mM（10~50mM）
（一）NaHCO3液： 7.4%、5.6%、3.7%三种浓度，三蒸水溶解，过滤除菌，小瓶分装，40C保存。也可用10Pa、10min高压蒸汽灭菌，虽有部分破坏，但方便。 （二）10% 醋酸液：高压灭菌，分装，40C保存 （三）Hepes液：是一种H+缓冲剂，维持恒定PH，20mM（10~50mM）

28 九、0.2M L-谷氨酰胺 L-谷氨酰氨 克（M=146.15）加适量500C三蒸水溶解，定容至100ml，滤过除菌，1ml / 安瓿，- 200C保存。 使用时，每100ml 培养基加1ml谷氨酰氨。

29 十、抗菌素液 （一）氢、链霉素（双抗）液 （二）卡那霉素 （三）制霉菌素

30 （一）氢、链霉素（双抗）液 母液： 链霉素：100万u/10ml 三蒸水（或Hanks液）
使用时： 0.1ml母液×10万u/ml/100ml培养基 =100u / ml 。

31 （二）卡那霉素 母液： 50000ug / 瓶 / 5ml Hanks = 10000ug / ml 使用时：
0.5ml母液×10000ug / ml / 100ml 培养基=50ug / ml。

32 （三）制霉菌素 使用时： 因其不能溶于水，只能制成5000u / ml 的悬液。
0.5ml 悬液×5000u / ml / 100ml 培养基=25u / ml 。

33 作 业 1、细胞培养成功需要满足其哪些条件？ 2、名词解释： （1）细胞生长培养基 （2）细胞维持培养基 3、天然培养基有哪些？各有何特点？
作 业 1、细胞培养成功需要满足其哪些条件？ 2、名词解释： （1）细胞生长培养基 （2）细胞维持培养基 3、天然培养基有哪些？各有何特点？ 4、平衡盐溶液有哪些主要功用？