第九章 维生素类药物的分析.

Presentation on theme: "第九章 维生素类药物的分析."— Presentation transcript:

1 第九章 维生素类药物的分析

2 维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。 人体不能合成维生素。

3 分类： 脂溶性 VitA、D2、D3、 E、K1 等 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸

4 第一节 维生素A的分析 全反式 -H 维生素A醇 -COCH 维生素A醋酸酯 -COC15H 维生素A棕榈酸酯 R :

5 结构与性质 一、 （一）为一个具有共轭多烯侧链的环己烯 1. 具有UV吸收 2.存在多种立体异构化合物

6 相对生物效价 顺反异构 维生素A 325.5 100% 全反式 新维生素Aa 328 75% 2－顺
新维生素Ab % －顺 新维生素Ac % ，4－顺 异维生素Aa % －顺 异维生素Ab % ，6－顺

7 3.易发生脱氢、脱水、聚合反应 VitA2 VitA3 鲸醇

8 共轭多烯侧链 易被氧化 （二） △或有金属离子存在时氧化↑

9 环氧化物 VitA醛 VitA酸

10 （三） 与三氯化锑发生呈色反应 CHCl3 溶解性 （四） 不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等

11 鉴别试验 二、 三氯化锑反应 （一） CHCl3 条件： 无水、无醇 水 SbCl3 SbOCl 乙醇可使碳正离子的正电荷消失

12 蓝色 紫红

13 UV法 （二） BP（2005） λmax为326nm 一个吸收峰 λmax为350～390nm 三个吸收峰

14 VitA ↓ 去水VitA（VitA3）

15

16 TLC法 （三） BP 对照品法 显色剂 三氯化锑 USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值

17 三、 含量测定 （一） UV法（三点校正法） 立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2）

18 三点校正法 1. 前提条件： （1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。

19 2. 波长的选择： （1）  VitA的max（如VitA酯 328nm） （2）  3 分别在1的两侧各选一点 第一法 等波长差法 测定对象：VitA醋酸酯 第二法 等吸收比法(皂化法) 测定对象：VitA醇

20

21 3、测定法 （1）基本步骤: 第一步：A选择，A328测定或A328校正 第二步：求 第三步 求效价

22 第四步：求标示量％ A*D*换算因数*W ＝ W*100*标示量 ×100％

23 换算因数： 单位E％1cm数值所相当的效价数 （由纯品计算而得）

24

25

26 （2） 第一法 维生素A醋酸酯 方法：

27 判断 是否在326～329nm之间 是 否 改用第二法 求算 并与规定值比较

28 规定值 差值 判断差值是否超过

29 有超过0.02 无超过 计算 A328（校正） 用A328计算 第二法 第二法 3% －15% －3% f

30 VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量 g/丸）的内容物 g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为

31 A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216 A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299 求本品中维生素A的含量？

32 + 0.01 －0.01 + 0.02 + 0.04 A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 － =

33

34 （等吸收比法） （3）第二法 [ 皂化法、6/7A法 ] 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法

35 脂溶性 水溶性

36 判断max是否在323～327nm之间 是 否 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算

37 判断 A300 /A325 是否大于0.73 否 是 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算A325(校正)

38 －3% 3% f

39 λmax 618nm～620nm （二） 三氯化锑比色法 标准曲线法 优点： 简便 快速 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 缺点：
优点： 简便 快速 缺点： 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性

40 （三）高效液相色谱法 色谱柱：C18柱 流动相：甲醇－水（96：4） 流 速:1.2ml/min 检测波长与AUFS:0min-8min(330nm,0.25AUFS)用于测定VA ; 8min后（292nm,0.05AUFS）用于测定VE 内 标：VA醋酸酯

41 第二节 维生素B1的分析 一、结构与性质 （一）结构 HCl Cl- 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵盐)

42 二、性质 (1)易溶于水 1.溶解性 (2)水溶液呈酸性 2.硫色素反应 3.UV 共轭双键 λmax = 246nm

43 4.与生物碱沉淀试剂反应 杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。 5.氯化物的特性

44 二、鉴别试验 （一） 硫色素反应 专属性反应

45

46 ＋2H 硫色素

47 （二） 沉淀反应 VitB1 H+ H+ H+ H+

48 （三） 其他反应 S元素反应 H+ Cl-反应

49 三、含量测定 非水溶液滴定法 （一） 喹那啶红－亚甲蓝 （紫红→天蓝）

50 （二） UV法

51 % E % E ChP 片剂、注射剂 A = ECL = 421 （每片）相当于标示量的%= 平均片重 A × D ×
× 标示量 % × W E A × cm × 100 D × 平均片重 1 1 （每ml）相当于标示量的 × 标示量 % × V E A × cm × 100 D

52 （三） 硫色素荧光法 原理 1、 NaOH

53 - A b = C样 - d S ´ ×C标 S + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 对照液 + NaOH + 异丁醇 d
供试液 b - A b = C样 ×C标 - d S 特点 3、 （1）灵敏度高，线性范围宽 （2）专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用于制剂分析，体液分析等。

54 第三节 维生素C的分析 结构与性质 一、 （一）结构 二烯醇 内酯 两个手性碳（C4,C5） L－抗坏血酸

55 （二）性质 1.溶解性 1、易溶于水 2、水溶液呈酸性 一元酸 2.酸性 C2－OH的 pKa = 11.57 C3－OH的

56 3.旋光性 手性C（C4、C5） * L(+)－抗坏血酸 活性最强 *

57 4.还原性 二烯醇结构 有活性 有活性 无活性

58 5.水解反应 与碱反应

59

60 6.具糖的性质 结构与糖类相似 糖类的显色反应 △ 50℃

61 7.UV特征 + H l 243 nm max - OH l 265 nm max

62 鉴别试验 二、 利用还原性：与氧化剂的反应

63 （一）与AgNO3反应 （二）与2，6 - 二氯靛酚反应 还原型 氧化型 玫瑰红色 蓝色 OHˉ

64 （玫瑰色） （无色）

65 （三）与其他氧化剂反应 与碱性酒石酸铜反应 USP 与KMnO4反应 （四）糖类的反应

66 （戊糖） (糠醛) 50℃ (吡咯) （蓝色）

67 （五）UV BP 0.01mol/L HCl

68 三、杂质检查 （一）溶液的澄清度与颜色检查 维生素C原料药 片 剂 注射剂 糠醛缩合呈色 （二）铁、铜离子的检查 原子吸收法 维生素C原料药
片 剂 注射剂 糠醛缩合呈色 （二）铁、铜离子的检查 原子吸收法 维生素C原料药 催化Vc氧化分解

69 四、含量测定 （一）碘量法 原理：利用Vc强的还原性 指示剂 淀粉指示液 H+

70 2、方法 原料药 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。

71 3、讨论 赶走水中O2 （1）新沸冷H2O （2）酸性环境 稀醋酸 减慢VitC被O2氧化速度 （3）立即滴定 减少O2的干扰

72 4.附加剂干扰的排除 片剂 ——过滤 注射剂 —— 抗氧剂 —— 丙酮 甲醛 Na2SO NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5

73 O a S 3 + H 2 N 5 C H O 2 H O N C S 3 a

74 (二)2，6 - 二氯靛酚滴定法 1、原理 2、方法 自身指示终点法

75 3、讨论 （1）酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC （2）快速滴定 min内 防止其他还原性物质干扰 （3）亦可剩余比色测定 （定量过量） （测剩余染料）

76 （4）缺点 不稳定 需经常标定 贮存≤一周 （5）优点 专属性强，多用于含 Vc的制剂和食品的分析

77 （三）高效液相色谱法 血浆中维生素C的测定 标准溶液包括样品预处理过程均需加入偏磷酸，偏磷酸同时可用于血样中的蛋白沉淀；当天取血当天测定；处理好的样品亦需冰箱保存

78 第四节 维生素D的分析 一、结构与性质 （一）结构 维生素 D2(麦角骨化醇) 维生素D3(胆骨化醇)

79 （二）性质 1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉 末；无臭，无味。 2.溶解性 宜溶于有机溶剂，在植物油中 略溶，在水中不溶。
1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉 末；无臭，无味。 2.溶解性 宜溶于有机溶剂，在植物油中 略溶，在水中不溶。 3.不稳定性 含有多个烯键，所以极不稳 定，宜氧化变质，效价降低， 毒性增强。

80 4．旋光性 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子 5．显色反应 甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色
5．显色反应 甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 6．紫外吸收特性 无水乙醇 nm 维生素D2 为460－490 维生素D3 为465－495 醋酐 硫酸 E 1% 1cm E 1% 1cm

81 二、鉴别试验 （一）显色反应 1．与醋酐-浓硫酸反应 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2．与三氯化锑反应 本品 橙红色 粉红色 醋酐 硫酸
氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2．与三氯化锑反应 1,2-二氯乙烷 三氯化锑试液 本品 橙红色 粉红色

82 3．其它显色反应 维生素D 橙黄色 绿色 （二）比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为＋102.5°至＋107.5° 维生素D3
三氯化铁 维生素D 橙黄色 二氯丙醇 乙酰氯 绿色 （二）比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为＋102.5°至＋107.5° 维生素D3 比旋度为＋105°至＋112°

83 薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱 （四）维生素D2、D3的区别反应 （三）其它鉴别方法 红色λmax570nm
乙醇1ml 和85%硫酸5ml 96%乙醇 取0.1ml 维生素D3 黄色 λmax495nm 10ml

84 三、杂质检查 （一）麦角甾醇的检查 洋地黄皂苷溶液 维生素D290%乙醇溶液 不得发生浑浊或沉淀

85 （二）前维生素D的光照产物

86 四、含量测定 正相高效液相色谱法 （一）维生素D测定法 含量以单位表示 每单位相当于维生素D 0.025μg

87 测定在半暗室及避免氧化的情况下进行 第一法：无干扰杂质 第二法：有VA及其他杂质干扰 第三法：用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 仅VD峰可分离

88 第一法 无干扰杂质 内标物：邻苯二甲酸二甲酯 色谱条件及系统适用性试验： 填充剂：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3）
检测波长：254nm

89 系统适用性试验 维生素D3 ＞1.0 ＞1.0 先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 % 溶液组成 分离度 前维生素D3
0.5 0.6 1.0 1.1 ＞1.0　 △ 光照 ＞1.0 先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 %

90 校正因子测定： 维生素D的校正因子: f1=Asmi/Aims 前维生素D折算成维生素D的校正因子: f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms） 含量测定：计算维生素D及前维生素D折算成 维生素D的总量 mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As

91 第二法 有VA及其他杂质干扰 第一步：皂化提取 供试品 OH- 加热回流 冷却 乙醚提取 乙醚提取液 挥干乙醚 残渣 甲醇溶解 供试溶液A

92 第二步：分离收集 供试品溶液A 供试品溶液B 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 第三步：按第一法进行含量测定（内标法）
内标的正己烷溶液 RP-HPLC 分离 收集 挥干 溶解 维生素D及前维生素D 第三步：按第一法进行含量测定（内标法）

93 第三法 第一步：皂化提取 同第二法得供试品溶液A 第二步： 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 供试品溶液C
用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 第一步：皂化提取 同第二法得供试品溶液A 前维生素D 维生素D 第二步： 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 RP-HPLC 收集 异辛烷溶解 90℃、1.5h 挥干 挥干 正己烷溶解 供试品溶液C 第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量

94 第五节 维生素E的分析 一、结构与性质 （一）结构 苯并－二氢吡喃醇

95 * * * 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ-生育酚 δ-生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1

96 dl－α－生育酚醋酸酯 生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10 （天然品） （合成品）

97 （二）性质 1、溶解性：易溶于有机溶剂，不溶于水 2、水解性：酯键易水解 3、氧化性 △ 4、UV

98 二、鉴别试验 硝酸反应 （一） 75℃15′ 橙红色

99 生育酚 强氧化剂 HNO3 （橙红色） 生育红

100 三氯化铁－联吡啶反应 （二） △ [O]

101 生育酚 Fe3+ [O] 对-生育醌 红色

102 UV法 （三） 0.01%无水乙醇中 λmax = 284nm λmin = 254nm

103 TLC法 （四） 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 显色剂 硫酸（105℃ 5′） VitE Rf = 0.7

104 利用游离生育酚的还原性， （二）生育酚 三、杂质检查 （一）酸度 游离醋酸 1.原理 将硫酸铈还原成硫酸亚铈 2.试剂
硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄→灰紫）

105 四、含量测定 GC法 （一） GC特点 1、 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好 挥发性低、不稳定、极性强→衍生化。易受样品蒸气压限制

106 2、VitE测定的色谱条件 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃ 检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 内标法加校正因子定量

107

108 内标法 供试液（样品+内标） 对照液（对照+内标） 是样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近 内标物

109 （二）RP - HPLC法（外标法） 样品→ dl－α－生育酚 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水（49 ：1） 检测波长→292nm R＞2.6 RSD≤0.8%

110 （三）荧光分光光度法 对照品→ dl－α－生育酚 在220~400nm波长范围内，以发射、激发波长间隔Δλ为40nm扫描同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。 F样品 F空白 - VE= 4.0（mg/L) F标准 - F空白

111 第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂
第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂 二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素 三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素