第八章 食品中致病菌和病毒.

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1 第八章 食品中致病菌和病毒

2 8.1 肠杆菌科 肠杆菌科是存在于人和动物肠道或自然界中的一群生物学性状很相似的革兰氏阴性短小杆菌。无芽孢，多数有周身鞭毛，能运动。
在普通培养基上能生长。 培养温度为35ºC。 需氧或兼性厌氧。 能还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性。

3 8.1.1大肠杆菌 大肠杆菌E. coli是肠道正常菌群。一般情况下，多不致病，是人和动物肠道中的常居菌。
在一定条件下，可引起肠道道外感染。 致病性大肠杆菌：肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli); 肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli); 肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E. coli); 肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli)。 引起腹泻、出血性肠炎。

4 肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli，ETEC)
引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般2~3d即愈。 鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定的参考意义。

5 肠致病性大肠杆菌 肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli，EPEC)是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可致死，成人少见。EPEC产生VT毒素。 VT毒素具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。 鉴定EPEC根据临床表现和血清型。

6 肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E. coli，EIEC)
EIEC可引起豚鼠角结合膜炎，临床上可借此协助鉴定EIEC。

7 肠出血性大肠杆菌 肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)可引起散发性或爆发性出血性结肠炎。主要菌型是O157：H7，还可有O26、O111、O103、O145等。 1996年O157：H7在日本引起万人的食物中毒，此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国等国家和地区相继报道了EHEC O157：H7的散发性感染和爆发流行。 我国于1999年在苏、皖、鲁、豫发生爆发流行。

8 肠出血性大肠杆菌O157: H7的检验方法： 1、培养基制备 改良EC新生霉素增菌肉汤 （mEC）： EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20μg/mL。 改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。 MUG-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L。 2、增菌培养 称取25克样品放入225mL mEC中，均质。于41±1℃培养18-24小时。

9 3、分离 将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。 可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。 4、鉴定 挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1℃培养18~24小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。 对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。 在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100℃水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。

10 EHEC O157:H7检验程序图解     检样25g     ↓     mEC225mL →酶联荧光免疫测试VIDAS快速筛选     ↓41±1℃，18-24h     10-4，10-5，10-6稀释度涂布TC-SMAC     ↓36±1℃，18-24h     挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST     ↓36±1℃，18-24h     MUG阴性培养物转种普通营养琼脂    ↓    ↓     生化反应鉴定    血清凝集鉴定或胶乳凝集试验

11 生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。　　
1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。

12 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
靛基质（Indole）试验： 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。                                                           

13 甲基红（Methyl Red）试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 V-P试验 　　 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物， 称V－P（+）反应。 大肠杆菌：MR + /VP -

14 枸椽酸盐试验： 某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。

15 用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E
用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。 如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法。

16 大肠杆菌的检测 （1）常规检测方法 国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

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18 原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。

19 (2) PCR方法 大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。
Gene-TARK研制出用浸染棒检测大肠杆菌中16SrRNA的探针，样品需前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体检测杂交复合物。 Hsu等报导此方法特异性（除相近的志贺氏菌外）达100％，假阳性率达1.2％。

20 8.1.2 沙门氏菌属（Salmonella) 沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。因此，沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一。 沙门氏菌属是肠杆菌科中最复杂的菌属。它属于革兰氏阴性杆菌。可根据沙门氏菌的菌体抗原（O抗原）分群（A, B, C等），再根据其鞭毛抗原（H抗原）分血清型（1、2等）。

21 沙门氏菌不产生外毒素，但能产生毒力较强的内毒素。
沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。可存在多种食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、虾、鱼和田鸡腿等。 沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。根据侵入机体沙门氏菌菌种的不同，在临床上引起四种不同的疾病。

22 （1）伤寒、副伤寒 由沙门氏属中的伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。 （2）食物中毒 沙门氏菌属引起的食物中毒，主要以肠炎杆菌、鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌和汤普逊杆菌等最为多见。临床症状主要是胃肠炎。病程较短，一般2~4d, 可完全恢复。 （3）败血症 多为猪霍乱杆菌引起，甲、乙、丙型副伤寒杆菌和肠炎杆菌亦可引起败血症。 （4）慢性肠炎 沙门氏杆菌可引起慢性、持久性肠炎。

23 从食品中分离沙门氏菌样品制备 由于食品种类繁多，且每类中包括许多品种。因其加工方式不同，导致性状各异。故在进行微生物学检验时，应按不同的形状、加工方式及检验目的合理进行检样处理。 检样处理 冷冻的检样 在检样前最好不要解冻，将沙门氏菌的损伤降低到最低限度。 粉状样品 应将225ml增菌液分数次加入，并用灭菌玻棒搅拌成均匀悬液。 带壳蛋类 在流水下用刷子刷洗蛋类，并沥干。将蛋类在含0.1％十二烷基磺酸钠的200mg/kg Cl-溶液中浸泡30min后方可破壳取蛋。

24 检测方法 从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通常采用的方法共分5个步骤：
前增菌：食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。 选择性增菌：此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。 选择性平板分离：采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。 生物化学筛选：排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。 血清学技术鉴定培养物菌种。

25 （1）沙门氏菌的增菌和分离 预增菌 将制备好的预增菌试液于35℃培养24h后，轻轻振摇培养液。 选择性增菌 选择性平板分离 混匀培养物，用直径3mm的接种环，1满环（10ul）分别划线接种于亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和HEKTONE氏肠道菌（HE）琼脂平板上，于35℃培养24h后，根据沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征挑取典型或可疑菌落。

26 （2）沙门氏菌的筛选和生化、血清学鉴定 ① 筛选 用灭菌接种针挑取每个典型或可疑菌落的中心部位，分别接种三糖铁（TSI）、赖氨酸铁琼脂斜面，于35℃培养24h。 在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物可使斜面呈碱色（红色），底层呈酸色（黄色），产生H2S（琼脂变为黑色）或不产生H2S。 ② 生化学、血清学鉴定 ③ 混杂培养物 对呈混杂的TSI琼脂培养物，皆应划线于MC、HE或XLD琼脂上，于35℃培养24h后，进行重新分离并至少挑取2个可疑菌落接种到斜面上进行鉴定。

27 ④ 纯培养物 将每个可疑阳性的TSI琼脂斜面培养物，分别接种于尿素肉汤中，35℃培养24h，获取多量的琼脂斜面培养物接种于快速尿素肉汤中，于37℃水浴培养2h。弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有呈阴性反应的培养物作进一步鉴定。 ⑤ 血清学多价鞭毛（H）试验 ⑥血清学多价菌体（O）试验 ⑦ 菌体（O）群试验 ⑧ 鞭毛（H）试验阴性培养物的诱导 （3）结果判定

28 8.3 弯曲菌 弯曲菌是一组人畜共患的病原微生物，能引起人的腹泻和食物中毒，在国外已被广泛的重视，同时也被公认为新发现的病原菌之一。
弯曲菌是革兰氏阴性菌，呈弧形和S型。 弯曲菌以病原菌和共生菌广泛存在于动物中，家禽家畜是主要的贮存宿主和传染源，在传染或带菌动物的肠道和生殖道内容物中含有大量的弯曲菌。食用被污染的食物、水，尤其是鸡、鸭、蛋，未消毒或消毒不完全的牛奶，均可致病。

29 检验方法 （1）常规方法

30 （2）现代检验技术 ① 基因探针法 核酸杂交试验是以互补核酸链能够特异性结合并形成稳定的双链复合物为基础。基因探针系统采用的是发光剂标记的单链DNA探针，该探针与核糖体RNA结合形成稳定的DNA:RNA杂交体。选择试剂将未杂交和杂交探针分开。标记的DNA:RNA杂交作用GEN-PROBE发光仪检测。发光仪读数大于或等于CUT-OFF值的为阳性，低于CUT-OFF值的为阴性。

31 ② PCR法 根据弯曲菌属16sRNA高保守序列设计一对引物；在合适的反应条件和反应体系下进行反应；最后利用电泳观察结果。 ③ 荧光酶标试剂盒 检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物为发光素。靶顺序为rRNA。近年来用碱性磷酸酶人工合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为一百万个菌落形成单位（CFU)，敏感性和特异性达100％。 此方法只在临床检测中应用，尚未用于食品检测。

32 8.4 金黄色葡萄球菌 葡萄球菌是一类革兰氏阳性菌。它的致病力的强弱与其产生的毒素及酶类有关。人一旦感染该菌，当机体抵抗力减弱或皮肤受损时，易被感染，引起伤口化脓、中耳炎、毛囊炎等。产生葡萄球菌肠毒素的还可引起食物中毒。 对人有致病性的葡萄球菌多产生α-溶血素；对动物有致病性的葡萄球菌多产生β-溶血毒素。

33 金黄色葡萄球菌某些菌株能产生一种能引起急性肠胃炎的肠毒素，当这些菌株污染了食物，在温度条件适宜时，即可产生相当数量的肠毒素，根据肠毒素的血清型别不同，分为A、B、C、D、E五型。其中以A型引起的食物中毒最多，B和C型次之。肠毒素是一种可溶性蛋白质纯化的肠毒素，能耐高温。

34 血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。血浆凝固酶具有抗原性，可分为8型。大多数致病性葡萄球菌能产生此酶，而非致病菌不产生。可应用8个型的凝固酶抗血清进行分型试验，用来研究葡萄球菌的流行病学情况。

35 检验方法 （1）常规检验方法

36 （2）现代检验技术 ① 利用mini－Vidas全自动免疫分析仪，它是应用酶联免疫技术，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高、速度快，可在48h的时间内快速筛选鉴定出金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌肠毒素。

37 ② 美国3M公司，利用耐热核酸酶特性，设计出纸片法，能在24h快速检测出金黄色葡萄球菌。
③ 大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素A、B、C和E。 ④ PCR法：设计特异性引物根据产生肠毒素A-E基因（entA, entB, entC, entD和entE),检测葡萄球菌exfoliative基因，检测中毒休克毒素基因(tst)。

38 8.5 肉毒梭菌 肉毒梭菌是严重食物中毒的病原菌之一，在厌氧的环境下能产生强烈的外毒素。这种毒素毒性强烈，是一种独特的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。该毒素性质稳定，是目前已知化学毒物和生物毒素中毒性最强烈者，对人的致死剂量为0. 1ug。

39 肉毒梭菌在自然界的分布具有某种区域性差异，显示出生态上的差异倾向。根据抗原特异性，可分为A、B、C、D、E、F、G七个型别。
肉毒梭菌一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有密切的关系。 欧美国家：肉类食品、罐头食品； 日本等沿海国家：进食水产品； 我国内地：进食发酵食品（如臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）。

40 检验方法 1）常规肉毒梭菌的检出 GB/T 4789.12-2003 2）PCR法 报告（一）：检样含某型肉毒毒素
报告（二）：检样含某型肉毒梭菌 报告（三）：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌

41 8.6 致病性弧菌 弧菌属共有37个种（变种），其中已明确又12个种对人类有致病作用。在这12种致病菌种，最重要的，也是问题最多的是O1型霍乱弧菌、非O1型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。 霍乱弧菌(Vibrionaceae cholerae) 霍乱弧菌是由O1血清群和O139血清群引起的烈性消化道传染病。该病传播快, 波及面广，是属于国际检疫的传染病。 水是传播霍乱的主要媒介。 与霍乱有关的食品主要是海产品、有壳的水生动物和甲壳动物，主要有鱼、虾、贝类、甲鱼、牛蛙、蟹等。

42 霍乱弧菌引起的疾病叫霍乱。 由霍乱弧菌E1 Tor生物型引起的症状较轻，病程也短。 霍乱弧菌肠毒素会引起机体严重的呕吐、腹泻等临床症状。 霍乱弧菌的检测方法 生物学检测方法，作霍乱弧菌O1+O139多价血清凝集试验（水、食品）。 PCR（对毒力基因ctxAB、tcpA进行扩增）。

43 致病性弧菌的检测方法 1、具有代表性检验方法简介 （1） FDA的细菌学分析手册
　霍乱、付弧、创伤弧菌和其他弧菌（ 修订）分别着重介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的方法。 　用PCR方法检测产肠毒素的霍乱弧菌叙述了霍乱肠毒素cholera Toxin (T)基因 （2） AOAC官方分析方法 　　牡蛎中的霍乱弧菌：升温富集法（1995.a） 　　创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法AOAC.(1995.b） 　　美国midi公司生产的shelock微生物鉴定系统。

44 （3） ISO方法 　　副溶血弧菌的检测方法（ISO8914：1990E） （4） NMKL 　　食品中致病性弧菌的检测和计数（NMKL N0156）介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的检测程序。 （5） 不同国家的方法 　　日本、瑞士等国均有相应检验方法。 2、致病性弧菌的检测方法 　　以上介绍的方法均是以单一或少数目标菌（NMKL为四种）为目的的设计的程序。鉴于国外对出口食品中多种致病性弧菌的要求和重视，有必要探讨“同一程序同时检测多种弧菌”方法。

45 检验程序 　　 g样品+225mL APW(1% NaCl pH9.0) 增菌 ↓37℃8-16h 取10mL加入双倍APW ↓37℃6-8h 选择 选择培养基 TCBS（霍利斯用非选择性的羊血球琼脂） ↓37℃24h 定弧菌 取黄色或绿色菌落做G染色、氧化酶、动力 ↓ O/129(150ug)、D-甘露糖 分组 初步鉴定：0% NaCl , 1% NaCl、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、(氧化酶) 分成5组 ↓ 确证 最后鉴定

46 8.7 病毒 8.7.1 诺瓦科病毒（Norwalk virus） 1972年首次发现。
诺瓦科病毒是直径27nm的圆形结构的病毒，无包膜，尚不能在实验室培养。 Norwalk病毒是最重要的引起腹泻的肠道病毒。食品（包括水）被诺瓦科病毒感染后，出现以急性肠胃炎为主的临床症状。目前，这类病毒尚无特效治疗药物。

47 20世纪70年代在澳大利亚爆发了有2000多人感染诺瓦科病毒。另一起病例原因是运垃圾船将垃圾倒在正在捕捞贝类的区域。
2006年11月，美国一艘名为“海洋自由”号的豪华邮轮，遭到了诺瓦克病毒的袭击，在为期一周的航行中，300多名乘客和船员感染了诺瓦克病毒，受感染的人数是这艘船搭载的总人数的7%。 诺瓦科病毒的毒力较强，发病有明显的季节性（秋冬季），一般不造成爆发流行。

48 在2006年底的一周内，日本各地小儿科医疗机构上报的诺瓦克病毒腹泻人数，达到了6万多人，发病率超过了有相关 统计25年来的历年最高纪录。根据推算，日本境内已经有超过300万人感染诺瓦克病毒。
自2002年以来，日本每年冬季都会爆发诺瓦克病毒，其中一些和牡蛎(生蚝)和生海鲜有关。2006年，日本媒体关注诺瓦克病毒和感染者在疗养院死亡的情况。2006年到2007年，诺瓦克感染例子几乎是之前的3倍。

49 检测方法 （1）免疫电镜法（IEM） NV被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要手段，具有直接、可靠的优点。电镜观察需要的样品量为106～107个病毒颗粒/mL排泄物。这个技术仅在发病早期适用。 免疫电镜能使电镜的灵敏度提高10-100倍。在显微镜下包被康复病人的血清。血清抗体玉同源病毒相结合，因此提高了诊断效率。但IEM不适合大规模流行病学调查。

50 （2）放射免疫和生物素－亲和素法（RIA法）
检测抗原与IEM法相比在灵敏度上没有明显差异，但用RIA法能检测出急性期和恢复期之间抗体升高 4倍以上，对流行病学调查更有意义。实验需6d，同时还需要放射性同位素标记。 （3）酶链免疫法（ELISA) 此法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法。这种技术的检测样品量要求104～106病毒颗粒/mL排泄物。

51 （4）杂交技术和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
RT-PCR方法是检测病人排泄物和环境中样品的诺瓦科病毒基因的特异手段。这个方法的灵敏度为102～104病毒颗粒/mL排泄物。高敏感的RT-PCR方法依赖于PCR引物的设计。依赖RNA的RNA聚合酶区域被认为是诺瓦科病毒基因组的最保守的区域。尽管用于扩增的RdRp区域基因的引物能扩增大多数的诺瓦科病毒，但由于诺瓦科病毒遗传多样性使这些引物很难扩增所有的诺瓦科病毒。

52 8.7.2 甲肝病毒（HAV） 病毒性肝炎是当前危害人类健康的疾病之一。
目前认为病毒性肝炎病原体至少有五种，包括甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戌型肝炎病毒（HEV），它们的特性、传播途径、临床经过均不完全相同，但它们均能引起肝炎病变。

53 项目 甲型肝炎 乙型肝炎 丙型肝炎 丁型肝炎 戌型肝炎 病毒 HAV HBV HCV HDV HEV 病毒分类 微小核糖核酸病毒 嗜肝脱氧核糖核酸病毒 黄病毒 （缺陷病毒） 杯状病毒 病毒大小 27nm 42nm 30～60nm 40nm 27～34nm 基因 ss RNA（+） 7.8kb dsDNA 3,2kb ssRNA(+) 10.5kb ssRNA(-) 1.7kb 3.5kb 抗原 HAVAg （VP1～4） HBsAg HBcAg HBeAg HCVAg HDVAg HEVAg 传播途径 肠道传播 肠道外及性传播 多数肠道外传播 多数和肠道外传播 潜伏期（范围） 25天（15～45天） 75天（40～120天） 50天（15～90天） 50天（25～75天） 40天（20～30天） 慢性化 无 3～10% 40～70% 2～70% 暴发性肝炎 0.2% 2～20% 0.2～10%

54 1973年Feinslone 首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中发现甲型肝炎病毒 (Hepatitis A virus,HAV ) 。属微小RNA病毒科，新型肠道病毒72型。人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，仅少数人表现为急性甲型肝炎。一般可完全恢复，不转为慢性肝炎，亦无慢性携带者。

55 HAV

56 甲型肝炎病毒主要的传染病源是甲肝病人。可通过污染水源、食物、食具和手等方式进行传播，特别是经水和食物，可引起爆发性流行。另外，通过血液也可传播。
病人的潜伏期为一个月，在潜伏后期和急性期，患者的粪便和血液均具有传染性。

57 检验方法 （1）免疫电镜 敏感性高，标本中含有104~106颗粒/mL可被检出。
将标本加入特异性抗体HAV血清，经孵育后，HAV颗粒与抗血清发生凝集，再用超速离心加以浓缩，取其免疫复合物，用磷钨酸盐进行染色，于电镜下检查HAV球形颗粒。 （2）固相放射免疫测定法 将放射性同位素与免疫化学相结合的体外测定超微量物质的实验方法，具有同位素技术的高灵敏性、准确性的优点，同时又兼有抗原抗体反应的专一性。

58 另外，检查方法还有补体结合试验、酶联免疫吸附和免疫黏附血凝试验等方法。通过利用葡萄糖球菌A蛋白可吸附IgG的方法，在单份血清中可区别甲肝抗体为IgM和IgG，根据急性期病人血清抗体为IgM，而恢复期病人的血清抗体为主要是IgG，可对甲肝急性期病人进行早期诊断。

59 8.7.3 疯牛病－朊病毒 疯牛病 (“mad cow” disease) 学名为“牛海绵状脑病” (Bovine Spongiform Encephalopath -- BSE) ，是一种发生在牛身上的进行性中枢神经系统病变，症状与羊瘙痒症类似，俗称“疯牛病”。病牛脑组织呈海绵状病变，并出现步态不稳、平衡失调、搔痒、烦燥不安等症状，通常在14至90天内死亡。由于种类的不同，疯牛病的潜伏期长短不同，一般在2到 30年之间。

60 20世纪80年代中期至90年代中期是疯牛病暴发流行期，主要的发病国家如英国及其他欧洲国家有大量的牛患病并被宰杀，发生疯牛病国家的牛肉及牛肉制品的出口受到了严格的限制。
尽管欧洲各国纷纷采取预防措施，但是到了1989年，疯牛病还是攻破了英国的近邻爱尔兰的大门。瑞士和法国1990年也各自发现了第一例疯牛病。到1997年11月，葡萄牙、丹麦、德国、荷兰、比利时也相继出现疯牛病。1998年疯牛病又跨出了欧洲，来到南美洲的厄瓜多尔。2000年后，西班牙、瑞典、捷克、希腊、斯洛伐克、芬兰、奥地利先后“陷落”。值得注意的是远隔千山万水的日本，在2001年也报告了亚洲首例疯牛病。2002年，以色列和波兰相继出现了国内首例疯牛病。

61 2003年5月，加拿大发现一例疯牛病，这是近10年来北美大陆发现的首例疯牛病。2003年12月，美国发现首例疯牛病。不到20年工夫，疯牛病就已扩散到了欧洲、美洲和亚洲的几十个国家。英国是发生疯牛病最多的国家，1999年统计占总发病数的99％。到2000年7月，在英国有超过34000个牧场的17.6万多头牛感染了此病，最高发病时间是在1993年1月，每月至少有1000头牛发病。截至到2002年，英国共屠宰病牛1100多万头，经济损失达数百亿英镑 。 截至2003年12月底，中国尚未发现疯牛病。

62 受疯牛病危害的不仅是牛，人若食用了被污染了的牛肉、牛脊髓等，也有可能染上致命的新型克－雅氏症。患者脑部会出现海绵状空洞，先是表现为焦躁不安，后导致记忆丧失，身体功能失调，最终精神错乱甚至死亡。新型克－雅氏症患者以年轻人为主，发病时间平均为14个月。截至2003年底累计已有至少137人死于新型克雅氏症，其中多数在英国。

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64 疯牛病是1985年4月最早在英国出现的一种新病。1996年确诊，1997年Weels等正式报道，疯牛病的致病因子是朊蛋白（Prion）。
朊蛋白是一种以糖蛋白为主体的特殊病原因子，其分子量很小。它是一种传染性蛋白因子，主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白（PrP）。 生物学特性： 可滤过性，增殖非常缓慢； 与已知病毒特征明显不同，不具有病毒结构，未检出核酸； 对福尔马林、蛋白酶、加热、电离辐射、紫外线抵抗力强；

65 分子量27000~30000D，由220~257个氨基酸组成，形成α螺旋β折叠，在油镜下，呈纤维状2股或4股缠在一起的蛋白丝，即prp蛋白。沉降系数40~200S，不含DNA或RNA。

66 β折叠 PrPC（正常） PrPSC（致病） 羊瘙痒病PrPC与PrPSC的三维结构

67 疯牛病的检测 根据临床症状和流行病学资料可建立初步诊断，确诊必须采用脑组织病理学检查、PrPSC检测（细胞免疫化学检查、免疫印迹、组织印迹、ELISA等）及PrP基因分析。 1998年爱尔兰报道了一种BSE免疫学检测，2h可报告结果，1d可检测1.4万头牛。

68 1999年7月Moynagh等报道了三种理想的方法：
1、单抗检测PrPSC的免疫印迹法（Prionics) 2、多克隆抗体检测PrPSC的化学发光ELISA（Enfer)法 3、在变性和浓缩后用两种单抗检测PrPSC的夹心免疫法（CEA）

69 8.7.4 禽流感病毒 禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。

70 非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均高，感染的鸡群常常“全军覆没”。

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72 禽流感的传播途径有哪些？  至今由禽鸟传人的禽流感有三种：甲型H5N1、甲型H7N7及甲型H9N2。禽流感主要通过横向传播，即通过易感禽类与感染禽类的直接接触或与病毒污染物的间接接触而传播，如被污染的饮水、飞沫、饲料及其他被污染的蛋筐、蛋盘、运输工具等。

73 被病毒污染的羽毛和粪便是重要的传染物，因为病毒含量高而且存活时间长，应特别注意。该病能否垂直传播，目前尚无足够的证据，但从自然感染禽流感病毒的鸡蛋蛋黄、蛋清及蛋壳中均能分离到病毒，所以感染鸡群的蛋不能用作孵化，不经消毒处理的不能运至非疫区。人感染禽流感的主要传播 途径是接触染病的鸡、鸭，也存在呼吸道传播的可能。