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免疫细胞的分离与检测
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第一节 免疫细胞的分类与分离 一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏
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免疫细胞的特征 1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性 2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
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免疫细胞的起源与分化 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞
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免疫细胞的分离技术 1、密度梯度离心法 2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法 5、其他分离法
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密度梯度离心法 稀释抗凝血 血浆 单个核细胞 淋巴细胞分离液 粒细胞 红细胞 离心前 离心后
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2r2（Q—Q0） x g 沉降速度 = 9 Q =颗粒比重 Q0 =溶质比重 r =颗粒半径
= 形状因子 = 颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数 = 粘稠度 g = 相对离心力
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人类血液有形成分的平均密度与直径 密度 直径（） 血小板 1.04—1.06 淋巴细胞 1.06—1.08 8—10
密度 直径（） 血小板 —1.06 淋巴细胞 — —10 粒细胞 — 红细胞 —
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黏附分离法 尼龙毛法 贴壁法 亲和板法 吸附柱法
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样品 荧光检测器 流体护套 滤光片 透镜 喷嘴 接物镜 偏转板 激光束 细胞收集管 荧光激活分离法（FACS）
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流式细胞仪
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磁性分离法 磁铁吸引法 磁式细胞分类术法
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N S MACS (阳性选择法）
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N S MACS (阴性选择法）
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其他分离法 花环沉降法 细胞活化克隆法 MHC分子四聚体法
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T 抗原肽-MHC分子四聚体技术
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细胞的冻存与复苏 细胞冻存的原理与方法 细胞复苏的原理与方法
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细胞冻存罐
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第二节 免疫细胞膜分子的检测 一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法
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免疫细胞膜分子检测的原理与类型 1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体
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免疫细胞膜分子的主要检测方法 1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法 2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）
3、花环形成试验
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SmIg的荧光抗体检测法
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SmIg的酶免疫检测法
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补体 染料 补体依赖的细胞毒试验（CDC）
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E-花环 花环形成细胞 B细胞 绵羊红细胞 T细胞
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EA-花环
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EAC-花环
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第三节 免疫细胞功能测定 一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验
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转化、增殖试验 1、淋巴细胞转化试验 2、混合淋巴细胞培养
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淋巴细胞转化试验原理示意 丝裂原（抗原）刺激 3H-TdR 放射性测定
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细胞毒检测试验 1、T细胞介导的细胞毒试验 2、NK活性测定 3、ADCC作用测定
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细胞毒试验原理示意 靶细胞 效应细胞 分离上清 放射性测定
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抗体形成试验 1、直接溶血空斑试验 2、间接溶血空斑试验 3、SPA-SRBC溶血空斑试验
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直接溶血空斑试验
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间接溶血空斑试验
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SPA-SRBC溶血空斑试验
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细胞吞噬与杀伤功能试验 1、细胞吞噬功能试验 2、细胞杀菌功能试验
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吞有颗粒的吞噬细胞数 吞噬百分率 = 计数的吞噬细胞数 吞噬细胞吞噬的总颗粒数 吞噬指数 = 计数的吞噬细胞数
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NBT还原试验 原理： N-N- C H+ N=N-R- N-NH2 C N=NH 四氮唑基（淡黄色） 甲月簪基（紫黑色）
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NBT还原试验 方法： 1、抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。 2、推片染色、镜检。 正常值：
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第四节 免疫细胞凋亡测定 一、细胞凋亡的概念与原理 二、细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡的概念与原理 1、细胞凋亡的概念 2、细胞凋亡的原理 3、细胞凋亡的特点
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细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。
细胞凋亡（apoptosis） 细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。
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凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡
细胞凋亡的过程 凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡
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细胞凋亡机制
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细胞凋亡的特点 1、细胞皱缩 2、染色质边集 3、凋亡小体出现
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细胞凋亡
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细胞凋亡的检测方法 1、形态观察法 2、生化检测法 3、流式细胞仪检测法
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形态观察法 普通光镜检测——HE染色 甲基绿-派诺宁染色 荧光显微镜检测——溴化丙锭染色 透射电镜检测——典型形态改变
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生化检测法 凝胶电泳法 原位末端标记法 二苯胺分光光度法
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凝胶电泳法 原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder） 方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象
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原位末端标记法（TUNEL） 原理：利用标记的dUTP，在TdT作用 下结合DNA断片的3’末端羟基， 显示断链DNA，提示凋亡
方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检
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二苯胺分光光度法 原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。
方法：裂解细胞 13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定
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上清液OD值 凋亡百分率 = 上清液OD值+沉淀OD值
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流式细胞仪法 原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可 显示凋亡细胞的特征性亚二倍体 峰。并可经计算分析得出凋亡百 分率。 方法：制备细胞悬液
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本章小结 1、免疫细胞的类型与分离技术 2、细胞的冻存与复苏 3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法 4、免疫细胞功能测定的原理与方法
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