第十章 转基因动物技术 刘智敏 基础医学院生物化学与分子生物学教研室.

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1 第十章 转基因动物技术 刘智敏 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

2 第一节 转基因动物 一、概述 转基因动物（transgenic animal）是指用人工方法将外源基因导人或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。

3 自1981年，美国的Brinster和Palmiter 获得世界上第一只转基因动物—“巨鼠”以来，国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因鸡等多种转基因动物。

4 小鼠（lit/lit）的金属硫蛋白的基因（MT）
大鼠生长激素基因 小鼠（lit/lit）的金属硫蛋白的基因（MT） MTrGH基因 显微注射法 小鼠受精卵 植入假孕鼠的子宫 21只小鼠，7中带外源基因 6只体型较原小鼠大一倍左右 著名的转基因超级小鼠或巨鼠实验

5 二、转基因动物的基本原理 转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。

6 转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因(reporter gene)或报告序列(reporter sequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子), 或者直接选用目的基因的天然启动子序列。

7 三、转基因动物的基本方法 1.显微注射法 （microifljection）
显微注射是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合到实验动物基因组中，从而得到转基因动物。优点是：导入基因的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大已达250kb）。

8 转基因动物的一般实验程序 克隆DNA 供体母鼠 酶解、分离、纯化、定量 注射激素（PMS，HCG），与公鼠交配 目的基因DNA片段 鼠受精卵
显微注射 注射DNA的受精卵 输卵管或子宫移卵 假孕母鼠 冻存的胚鼠组织 取出鼠胚胎 胎鼠组织 制备DNA 娩出幼鼠 传代转基因鼠 冻存幼鼠血液 制备转基因鼠的DNA、蛋白质 表达水平检测 外源基因的整合检测 确定转基因鼠 幼鼠尾巴

9 2.胚胎干细胞法 （embryonic stem cells， ES细胞）胚胎干细胞是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。

10 3.逆转录病毒感染法 将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。

11 4.精子载体法 通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子，然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。

12 5.转基因动物中外源DNA的检测 染色体和基因水平Southern 杂交、FISH、 PCR等
转录水平 Northern 杂交、RT-PCR等 蛋白质水平 Western blot

13 四、转基因动物的应用 ①对基因组织或阶段特异表达的研究；②通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；③导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因；④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究；

14 ⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型； ⑥对遗传性疾病的研究；⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；⑧动物新品种的培育；⑨基因产品的制备；⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。

15 五、已建立的人类遗传病的转基因动物模型 疾 病 转移基因 多发性家族性淀粉状蛋白神经病变 突变的fransthyretin基因
疾 病 转移基因 多发性家族性淀粉状蛋白神经病变 突变的fransthyretin基因 自毁容貌综合症 突变的HGPRT基因 唐氏综合症 Cu/Zn-SOD酶基因 老年痴呆症 -淀粉状蛋白体基因 成骨不全症 突变的1胶原蛋白前体基因 肺气肿 突变的人PiZ 1-抗凝乳蛋白酶基因 原发性高血压 小鼠Ren-2肾上腺素基因 II型糖尿病 胰岛淀粉状多肽基因 镰刀型细胞贫血症 人和a珠蛋白基因，人2和珠蛋白基因 地中海贫血症 人珠蛋白基因 卡波齐肉瘤 HIV tat基因

16 第二节 基因打靶 基因打靶（gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活动内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knock-in）。目前这种技术主要在小鼠ES细胞中进行。

17 一、基因打靶的必备条件 1.胚胎干细胞 ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5大的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES细胞体外贴壁生长时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。

18 2.打靶载体 打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。
（1）neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，neo基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。 （2）HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因，它编码TK，ＴＫ除可以催化脱氧胸苷

19 变成脱氧胸苷酸外，还可以催化一些单核苷类似物磷酸化，这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有很强毒性。
将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中，当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分（含HSV-tk基因）是不能被整合到染色体中的，转化细胞能够在含G418和单核苷酸类似物ganciclovir的培养基上生长。如果细胞能在G418培养基上生长,但不能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中。

20 二、基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞 将基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种

21 线性质粒载体 同源基因片段 neo 外源基因 重组质粒 Es细胞 tk

22 载体整合 G GCV G GCV 生长 死亡 生长

23 三、基因打靶在医学中的应用 1.基因打靶与遗传病 遗传病是直接由遗传物质发生改变所造成的，如基因突变或染色体畸变等。基因打靶技术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。通过基因打靶途径建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），是研究疾病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。

24 2.基因打靶与肿瘤的研究 利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。

25 3.基因打靶与生物制药 国外有家制药公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。

26 四、基因打靶的应用举例 基因敲出 为了研究MHC I分子的功能，有人构建了含有10kb 2微球蛋白基因序列的载体，并将Neo抗性基因插入第二个内含子中，将它转移到ES细胞中与内源2微球蛋白基因发生同源重组，通过正-负筛选法得到了转基因的ES细胞，鼠内源的2微球蛋白基因的功能被破坏，在得到的转基因纯合鼠完全缺失了MHC I，但其发育与野生型无区别，由此证明，MHC I在发育过程中毫无作用，但转基因纯合鼠缺少CD8+T细胞，因此对病毒感染的抵抗力非常低，表明细胞免疫出现缺陷。

27 基因敲入 乳腺生物反应器:动物乳房是一种高度分化的专门化腺体，合成蛋白质的能力非常强，特别是一些经过人类长期遗传改良，专门用来产奶的乳用动物品种，合成蛋白质的能力十分惊人。一头优良的乳牛，在305天的产奶期内可以生产牛奶10 000kg，在高峰期每天可以产出牛奶100kg以上。

28 表一、动物产奶量及奶中蛋白质含量 动物 年产奶/kg 蛋白含量，% 年产纯蛋白量/kg 外源基因 年表达量 Kg
花奶牛 （2 g/L） 奶水牛 奶山羊 (6g/L) 奶绵羊 (15g/L) 猪 (1g/L) 兔 （10g/L）

29 表二、建立动物乳腺生物反应器生产畜群的时间（月）
动物 G0出生 G1出生 G2出生 G3出生 Kg Kg 牛 山羊 绵羊 猪 兔 ——

30 表三、已建立的人类遗传病的转基因动物模型
疾 病 转移基因 多发性家族性淀粉状蛋白神经病变 突变的fransthyretin基因 自毁容貌综合症 突变的HGPRT基因 唐氏综合症 Cu/Zn-SOD酶基因 老年痴呆症 -淀粉状蛋白体基因 成骨不全症 突变的1胶原蛋白前体基因 肺气肿 突变的人PiZ 1-抗凝乳蛋白酶基因 原发性高血压 小鼠Ren-2肾上腺素基因 II型糖尿病 胰岛淀粉状多肽基因 镰刀型细胞贫血症 人和a珠蛋白基因,人2和珠蛋白基因 地中海贫血症 人珠蛋白基因 卡波齐肉瘤 HIV tat基因 乙肝（HBV） 广州空军医院全军肝病中心转基因工程研究室 丙肝（HCV） HCV结构基因(2001,上海二医大)

31 四、中国的转基因动物研究 我国政府和科学界对转基因动物的研究和应用十分重视。在国家“七五”技术攻关计划中首先设立了“动物个体表达系统研究”的课题，启动了转基因动物的研究。在农业部的“七五”生物技术重点项目中，又设立了“动物转基因技术研究”的课题。1987年，当首期"863"计划生物技术领域研究项目开始实施时，把“猪的基因工程育种”列为重要项目之一，一直坚持到20世纪末。在“九五”期间，“863"生物技术研究计划又把“动物乳腺生物反应器研究”增列为重大项目，给以重点支持。

32 表四、我国的转基因动物主要成就一览表 转基因 动物 转移基因 单 位 转基因猪 poMT-pGH基因 中国农业大学 ?基因 新疆畜牧科学院
转基因小鼠 α-GT基因 上海细胞所 湖北农科院 HDAF基因 -抗凝乳蛋白酶基因 人体白蛋白基因 湖北农科院 (3万/月) 转基因鸡 人瘦素蛋白基因 复旦大学等 转基因山羊 人凝血因子基因 上海医学遗传研究所、复旦大学 转基因牛 人体白蛋白 基因 上海医学遗传研究所 ｍＡＡＴ（修正的人抗胰蛋白酶）基因 转基因鱼 鱼GH基因 中国科学院水生生物研究所 转基因兔 hGH基因 “863”计划动物乳腺生物反应器项目组

33 第三节 转基生物的安全性 生物安全性问题 在生物安全性方面人们主要考虑以下8个问题：①转基因植物的扩散问题；②转入植物的外源基因的扩散问题；③转入植物的其他标记基因(如抗生素抗性基因)的扩散问题；④转基因植物是否会影响生物多样性，即生物“入侵”问题；⑤转基因植物是否会改变与之相关物种(如害虫)的进化速度；⑥转基因植物中标记基因的毒性问题；⑦转基因植物的果实或其他部分作为食物是否会引起食用者产生不良反应，特别是有无可积累的长期作用；⑧转基因植物是否会对农业和国际贸易带来一些不可预测的影响。