试管动物 Test-tube Animal.

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1 试管动物 Test-tube Animal

2 概述 “试管动物”的概念 “试管动物”的主要研究内容 “试管动物”的发展历史 “试管动物”的基本程序 “试管动物”研究存在的问题

3 “试管动物” 的概念 在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程，称为体外受精(in vitro fertilization，IVF)。由于卵子和精子的受精过程是在 实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。

4 “试管动物”的主要研究内容 一、体外受精 卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)
精子体外获能(capacitation) 卵子和精子的体外受精(in vitro fertilization, IVF) 受精卵的体外培养(in vitro culture, IVC) 二、胚胎移植(embryo transfer，ET)

5 “试管动物”的发展历史 1878年，澳大利亚科学家Schek就用兔进行过实验，此后Onaoff、Pincus等科学家曾对家兔和小鼠进行过体外受精。 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚Austin发现精子capacitation现象以来，哺乳动物体外受精技术的已经走过了半个世纪的历程。 1957年，张民觉和Austin在实验中发现了受精前的试管小兔。 于1970年、1974年和1978年分别产下了世界首例试管小白鼠、试管大白鼠和试管婴儿。 1982年，美国人Brackett等成功报道了世界首例体内成熟的卵母细胞经体外受精后获得试管犊牛。 我国学者卢克焕在爱尔兰建立了一整套牛体外受精技术体系，并利用该技术体系于1987年生产了世界上数量最多的试管牛群，并于1988年初又研究成功了世界首例完全体外的试管双犊。 蒋和生等于1993年利用体外成熟的卵母细胞进行IVF，获得了我国首例试管水牛。

6 “试管动物”的基本程序

7 “试管动物”的基本程序 （一）卵母细胞的采集 1、离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞（主要来源） （1）卵泡抽吸法
（2）卵巢解剖法 2、活体采卵：是从活母畜的卵巢采集卵母细胞（优良品种） B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有B超探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞。其优点是可反复进行采卵而对母畜伤较少。其缺点是技术难度较大，而且需要较昂贵的B超设备。

8 卵母细胞的采集

9 （二）卵母细胞的体外成熟（IVC） 1、培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。
3、培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22～24h，而马为30～36h，猪为40～44h。 4、培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。

10 （三）卵母细胞的体外受精（IVF） 1、精子的制备：悬浮法（swim up）；直接离心法；哌可（Percoll）密度梯度离心法
2、精子获能处理：肝素处理法；钙离子载体法；高渗溶液处理法 3、受精液：通常使用Tyrode’s改良液 4、受精方法：微滴法、四孔培养板法 5、精卵共培养的时间、温度和气相：受精后，卵母细胞应立即放入温度39℃，含5％CO2的空气和最大相对湿度的CO2培养箱中培养24～44h，其中牛22～24h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养18～33h。受精后40～44h检查受精卵的分裂率

11 （四）早期胚胎的体外培养（IVC） 1、培养液：基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物和蛋白质等。
2、胚胎体外培养系统：常规培养系统、输卵管离体培养系统、与体细胞共培养系统。 3．培养方法：卵子在受精24h后，转移到预先制备好的颗粒单层中继续培养。一般使用微滴培养法。 4、培养的温度和气相环境：和卵母细胞成熟的条件一样。 5．胚胎的回收及其质量评定：以牛为例，整个体外受精程序，从卵母细胞成熟培养开始，经过体外受精和体外培养直至受精卵发育到囊胚阶段，一共经历8d的时间。如定受精当天为0d，则受精后第5～6d即可回收桑椹胚，第7～8d回收囊胚。

12 （五）胚胎的移植（ET） 手术法移植：在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植管将含有胚胎的培养液或冲冼液注入到子宫角内或输卵管内。 非手术法移植：（1）先将胚胎装入0.25ml的塑料细管内；（2）直肠检查黄体位置后，最好先作硬膜外腔麻醉，然后似人工授精般将胚胎用移植管通过子宫颈放入到与黄体同侧的子宫角的大弯或大弯深处内，或两侧子宫角各放一枚胚胎。 一般来说，用非手术法移植不如手术成功率高，因为容易损伤子宫角引起炎症，使胚胎不能顺利附植。非手术法成功率为25％-45％，而手术法可达 60％-65％。

13 胚胎移植

14 “试管动物”研究存在的问题 多精受精 长期以来多精受精问题一直是体外受精的一个难点。目前，判定卵母细胞成熟的标准是核成熟(MII) 但是，仅仅根据核成熟来判定卵母细胞的成熟看来并不全面，卵母细胞成熟应包括核成熟、细胞质成熟、透明带成熟等。这样卵细胞在受精过程中才能发生协调完整的生理变化，保证多精阻拒，以及激发精子在卵母细胞内继续发育的能力。 细胞期的阻滞现象 Bowmane等人发现体外培养的哺乳动物早期的胚胎(受精卵)存在着发育阻滞的现象。目前，为了克服阻滞现象，有助于产生高质量的桑椹/囊胚胚胎，主要采取以下方法，一是利用临时中间受体，即把的牛体外受精卵放入结扎的中间受体兔或绵羊的输卵管中，培养至桑椹胚或囊胚，再移植到受体或冷冻保存;二是体外受精卵在体外与体细胞联合培养。三是胚胎培养在简单的培养液中，无任何体细胞支持。其中有合成输卵管液(SOF)，补充血清或BSA和氨基酸。孵育在38.5℃，5%CO2中也能成功地用于培养。 腔前卵泡利用率低 目前，用于牛体外受精的卵泡都是有腔卵泡，对腔前卵泡的利用率很低。

15 Thank You