黑龙江省重点学科检查汇报 蛋白质组学主要研究技术 哈尔滨医科大学 生物化学与分子生物学学科 刘 兴 汉

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1 黑龙江省重点学科检查汇报 蛋白质组学主要研究技术 哈尔滨医科大学 生物化学与分子生物学学科 刘 兴 汉
哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 省部共建国家重点实验室培育基地— 黑龙江省生物医药工程重点实验室

2 人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引出了更多的问题：
大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）的概念就是在这个基础上提出的。 1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。

3 蛋白质组学研究内容 蛋白质鉴定： 双向电泳结果找出差异蛋白质电 对差异点蛋白质： 分子量及等电点分析
western blot或者免疫共沉淀等技术初步鉴定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中比对确定蛋白质的家族归属。

4 蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰： 磷酸化 乙酰化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式

5 蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术

6 蛋白质功能研究： 噬菌体表面展示技术(phage surface display) 酵母杂交技术（yeast hybridization） RNA干扰技术 蛋白质鉴定 双向电泳技术 质谱分析技术

7 蛋白质相互作用的研究技术 蛋白质：结构蛋白 功能蛋白 生命基本过程是功能蛋白质在时空上有序和协调作用的结果
从研究单一蛋白质的结构与功能关系发展为研究蛋白质间的相互作用

8 一、蛋白质相互作用的种类 分子或亚基的聚合 四级结构蛋白质亚基间的互相聚合 聚合的亚基是固定不变的 聚合靠氢键、疏水作用力等次级键 分子杂交
同工酶亚基间的聚合 聚合的亚基是可变的 聚合靠次级键

9 分子识别 蛋白质之间普遍存在的专一性结合作用 抗体与抗原、酶与底物、配体与受体 结合局部构像相嵌互补，必要时局部构像发生变化 局部有相应的化学基团产生足够结合力 分子自我装配 在特定条件下生物大分子自动装配成具有生物活性的细胞器或病毒 蛋白质、核酸、糖装配成核糖体 多酶体 相关的酶彼此有机的结合在一起 丙酮酸脱氢酶：丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶

10 二、蛋白质间作用力 氢键 主链氢键：二级结构 侧链氢键：三、四级结构 表面氢键: 蛋白质间作用 离子键 正电荷与负电荷间的静电引力
表面氢键: 蛋白质间作用 离子键 正电荷与负电荷间的静电引力 酸性氨基酸和碱性氨基酸多在球形蛋白质的表面，解离的带电基团互相吸引 和溶液的盐浓度有关

11 疏水作用力 在水介质中球形蛋白质形成立体结构时总是趋向于将疏水基团包埋在分子内部。 不是疏水集团之间有吸引力，是疏水基团出自避开水的需要被迫靠近。 在生理温度范围内随温度增高而增加 范德华氏力 极性分子或极性基团之间定向效应 极性物质和非极性物质之间诱导效应 非极性分子或基团之间的分散效应 单个力很小但数量很大

12 三、噬菌体表面显示技术-筛选结合结构域 技术建立的原理和条件： 1.抗原抗体反应 抗原抗体特异性反应通过抗原决定簇实现
抗原决定簇位于分子表面，5-7氨基酸组成 2.多肽在噬菌体表面有独立活性 3.多肽化学合成技术的日趋成熟

13 丝状噬菌体特点： 基因组是单链DNA,只能感染F＋细菌 复制形式是双链，可用于基因操作和转化 有5种结构蛋白： PⅢ通过与F菌毛结合感染细菌 PⅧ与噬菌体的成熟和稳定有关

14 PⅢ蛋白： 显示的蛋白或多肽 穿膜区：与噬菌体侵入有关 受体结合区：结合F菌毛 C端疏水区：锚定在噬菌体外壳 噬菌体
424个氨基酸，18氨基酸是信号肽，插入片段大，低拷贝

15 PⅧ蛋白： 73个氨基酸 23个氨基酸的信号肽 1-5:可活动区，露出噬菌体表面，插入多肽 6-24:占据噬菌体表面 25-35:高度疏水区 36-50:与DNA结合，构成噬菌体内壁 高拷贝，插入的片段小

16 技术操作 （一）噬菌体载体： 1. 噬菌体载体 由噬菌体基因组改造而成 含有完成噬菌体生命周期全部遗传成分 一种抗生素遗传标记 一对限制酶切点 2.噬菌粒 噬菌体和质粒的杂合体 质粒的复制子和抗性基因 噬菌体的PⅢ基因或PⅧ基因及基因间隔区 间隔区有单链DNA合成和包装信号 感染细菌后需辅助噬菌体协助包装

17 （二）合成编码随机短肽的核苷酸序列： （NNK）x或（NNS）x N=A、T、C、G K=G、T S=G、C x=氨基酸数 NNK或NNS组成32个密码代表20种氨基酸和一个终止密码TAG 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA 都是简并密码 第三硷基用C或T :互为简并密码

18 AAG X4=32密码 T 终止密码ＴＡＧ ATG 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA T 都有简并密码 AGG 第三个碱基：Ａ和Ｇ是简并密码 T Ｔ和Ｃ是简并密码 ACG T

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20 随机多肽文库的建立 （1）随机多肽基因合成： 随机部分（NNK)6，N:等量4种碱基 K:等量G/T两种碱基 两侧加酶切位点 经PCR扩增 酶切合成的基因片段 （2）载体酶切，与合成基因重组，转化 （3）细菌培养 （4）在培养液中收集噬菌体颗粒 多肽种类=206,肽库必须足够大

21 肽库的筛选 受体蛋白 生物素标记 生物素—受体蛋白 噬菌体肽库 滴定板微量 生物素—受体蛋白—多肽噬菌体 链亲和素
洗去未结合噬菌体 酸洗脱 插入特定多肽的噬菌体

22 鉴 定 插入特定多肽噬菌体 提DNA 测序 由DNA序列推测多肽氨基酸序列 合成多肽 分析结构和功能

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24 四、酵母双杂交技术-蛋白质相互作用 一、酵母双杂交系统的原理 二、酵母双杂交系统的操作程序 三、酵母双杂交系统的应用
四、酵母双杂交系统的局限与发展

25 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 也叫相互作用陷阱（Interaction trap）
由Fields和Song于1989年建立 用于研究细胞内蛋白质与蛋白质间的相互作用。

26 （一）、酵母双杂交技术原理 酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激活因子结构与功能的认识 真核生物转录激活因子 DNA结合结构域
转录激活结构域 AD BD 组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响

27 N端 C端 酵母转录因子GAL4 147AA 213AA AD BD LexA蛋白 单纯疱疹病毒的VP编码区 大肠杆菌的LexA蛋白 BD AD

28 选择酵母细胞作为双杂交系统的宿主菌株： 1.酵母细胞具有翻译后加工功能 2. 酵母细胞有很多的营养缺陷型标记，筛选阳性克隆比较方便、容易。 3. 酵母细胞有性生殖形成二倍体细胞，转化容易，转化率高

29 构建两种可在大肠杆菌和酵母细胞中复制的穿梭质粒载体
1. Ampr基因-大肠杆菌筛选标记 2. Trp、Leu-酵母筛选标记 3. X与BD以融合蛋白形式表达，Y与AD以融合蛋白表达 ３ pGBT9质粒 pGAD424质粒

30 报告基因 在GAL4结合的顺式作用元件下游需连接报告基因。 目前应用最多的报告基因是LacZ基因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色菌落。 其次是His基因，表达后能使酵母菌在缺少组氨酸的培养基中生长。 现在多提倡两种报告基因同时应用，颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以降低假阳性的出现

31 表达 酵母双杂交原理示意图

32 （二）、酵母双杂交系统的操作程序 1. 构建X蛋白表达质粒
将X蛋白基因与BD质粒重组，转化大肠杆菌，用Amp抗性标记筛选阳性克隆，测序验证，并通过SDS-PAGE和Western Blotting检测融合蛋白。

33 2. 构建Y蛋白表达质粒或预转文库 如Y蛋白是已知蛋白，则将Y蛋白基因与AD质粒重组。如Y蛋白是未知蛋白，则需用AD质粒构建cDNA文库。要求文库含有足够的转化子，数量在107以上，保证文库内含有研究者所感兴趣的蛋白。

34 3. 从大肠杆菌中提取两种重组质粒共转化酵母细胞
在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal的培养基上筛选 在此培养基上生长的蓝色菌落证明X蛋白和Y蛋白能互相作用。

35 酵母的接合型 a接合型 α接合型 单倍体 二倍体 单倍体 DNA-BD载体 DNA-AD载体 转化 转化 a接合型酵母 α接合型酵母
单倍体 二倍体 单倍体 DNA-BD载体 DNA-AD载体 转化 转化 a接合型酵母 α接合型酵母 Trp筛选 Ｌｅｕ筛选 Trp、Leu、His 蓝色菌落 X和Y蛋白相互作用

36 X基因与DNA-BD质粒重组 Y基因与DNA-AD质粒重组 分别转化大肠杆菌 Amp培养基 X-BD重组质粒 Y-AD重组质粒
共转化酵母细胞 Trp和Leu营养缺陷培养基 Trp、Leu、His营养缺陷培养基 X-gal 无菌落生长 蓝色菌落 X和Y蛋白相互作用 X和Y蛋白间无作用

37 （三）、酵母双杂交系统的应用 1. 检测两种已知蛋白质之间在体内是否存在相互作用. 这是酵母双杂交系统最基本用途
将两种已知蛋白质的编码基因分别克隆到BD载体和AD载体上，共同转染酵母细胞。若报告基因得到表达，则证明两种蛋白质之间在细胞内存在相互作用。

38 2. 筛选与已知蛋白质相互作用的新的蛋白质。 这是酵母双杂交技术最广泛，最有价值的用途 将已知蛋白质基因克隆在BD载体上，将要筛选的 cDNA库克隆在AD载体上，据此可从cDNA库中筛选出能与已知蛋白质相互作用的新蛋白质。

39 3. 确定蛋白质之间相互作用的结构域或活性区 将一个蛋白质突变或缺失掉不同的片段，再检测两种蛋白质在双杂交系统中还能否保持转录激活作用，从而确定蛋白之间相互作用的结构域或活性区。 4. 筛选多肽类新药 将药物作用的靶蛋白基因克隆在BD载体上，待筛选的多肽药物基因克隆在AD载体上，从中筛选作用于靶蛋白的多肽类新药

40 5. 绘制蛋白质相互作用网络或图谱 双杂交系统的BD及AD质粒均接上cDNA库，让它们随机表达蛋白 通过检测报告基因的表达可以证实一系列崭新蛋白中两两间的相互作用 如能证实在蛋白质A-B、B-C和C-D间都存在相互作用，据此可绘制出A→B→C→D的蛋白间联系图谱

41 （四）、酵母双杂交系统的局限与发展 酵母双杂交系统局限性
某些诱饵蛋白具有自身激活性质。 双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。

42 有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。
4. 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。

43 酵母双杂交系统的发展 1. 哺乳动物细胞双杂交系统 主要增强蛋白质翻译后的修饰作用，用于检测在酵母细胞中修饰不完全的蛋白之间的相互作用
单纯疱疹病毒BP16编码区取代GAL4的AD结构域 氯霉素乙酰转移酶或荧光素酶为报告基因

44 2. 细菌双杂交系统 直接在细胞质内研究蛋白之间相互作用，适用于不能进入细胞核的蛋白质。 百日咳博代杆菌中腺苷酸环化酶催化结构域可分为T18和T25两个相对独立的功能单位

45 只用双杂交系统中的DNA-AD质粒，不用DNA-BD质粒，故称为单杂交系统
3. 单杂交系统 用于研究蛋白质与DNA的相互作用 检测蛋白质能否和DNA结合 筛选能和DNA结合的蛋白质 只用双杂交系统中的DNA-AD质粒，不用DNA-BD质粒，故称为单杂交系统 待研究的蛋白质可看作双杂交系统中GAL4的BD结构域 将待研究蛋白质基因与DNA-AD质粒重组，以融合形式表达AD-蛋白质 重组质粒转入酵母细胞

46 酵母单杂交原理示意图

47 4. 反向双杂交系统 鉴定导致蛋白质不能相互作用的突变 鉴定能破坏蛋白质相互作用的因子 采用反式选择性报告基因 Ure3基因编码的酶催化嘧啶类似物5-氟清酸转化成细胞毒性物质，使细胞死亡 两种蛋白质能相互作用，Ure3基因表达，细胞死亡 两种蛋白质不能相互作用，Ure3基因不能表达，细胞得以生长

48 5. 三杂交系统 研究蛋白质与RNA的相互作用 X为能与RNA特异结合的蛋白质，其基因与DNA-BD质粒重组，表达BD-X融合蛋白 待研究蛋白Y基因与DNA-AD质粒重组，表达AD-Y融合蛋白 另有质粒转录特定的RNA 三种质粒同时转入酵母细胞

49 酵母三杂交原理示意图

50 三杂交系统中有三个杂交体 BD-X和AD-Y两个融合蛋白不能直接作用，必须通过与RNA结合，间接地激活报告基因 BD-X的X蛋白必有与RNA结合的结构域 检测的是Y蛋白和RNA间有没有作用 RNA可以换成蛋白质、小分子多肽、有机配体等 扩展三杂交系统的应用范围

51 五、RNA干扰技术 RNA干扰（RNA interference，RNAi）: 由双链RNA诱导的同源mRNA降解，导致该基因表达沉默的过程
沉默基因表达，研究基因功能

52 RNAi的发现主要源于两类研究 : 1990年Napoli和Stuije领导的小组将与合成粉红色素相关的查耳酮（chalcone）合成酶基因转入牵牛花，试图获得更艳丽的花朵。
结果不仅没能使花朵更艳丽，反而开出了白色花朵。转入的基因没有表达，同时还关闭了牵牛花中同源基因的表达

53 1998年Fire等发现，与反义或正义RNA导入线虫相比，直接导入双链RNA能够更有效地使基因沉默，并将这种由双链RNA引起的特异性基因表达抑制现象称作RNAi。

54 RNAi现象广泛地存在于植物、线虫、果蝇和脊椎动物，甚至所有的生物中，是生物进化过程中发展起来的一种古老的抵抗外来基因侵入的防御方式。

55 （一）参与RNAi过程的几个重要成员 1. 双链RNA或小分子干涉RNA （small interfering RNA, siRNA） dsRNA来源：病毒感染 转座子 转基因 dsRNA被Dicer酶降解成siRNA siRNA(21～23nt)直接诱导RNAi

56 2. Dicer酶 解旋酶结构域 PAZ结构域（PAZ为Piwi Augonaute、 Zwill/pichead蛋白的缩写，Augonaute 2是RISC的主要成分） 两个RNaseⅢ催化域 两个dsRNA结合结构域 Dicer将dsRNA降解成si RNA 双链RNA是Dicer酶的激活剂

57 3. RNA诱导的沉默复合物 4. 依赖RNA的RNA聚合酶
（RNA-induced silencing complex, RISC） siRNA和多种蛋白质组成，有核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶的活性, 是介导mRNA序列特异性裂解的复合酶 siRNA与mRNA中的同源序列结合，引导RISC在结合部位降解mRNA 4. 依赖RNA的RNA聚合酶 以siRNA为引物，以mRNA或病毒单链RNA为模板，合成dsRNA.

58 （二） RNAi的发生机制

59 六、双向凝胶电泳 一、双向凝胶电泳的原理 二、双向凝胶电泳技术操作的基本过程 三、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题 四、双向凝胶电泳技术在医学中的应用

60 （一）、双向凝胶电泳的原理 + - 等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 蛋白质是两性电解质
在等电聚焦中蛋白质总是向与其等电点相同的pH位置移动并停留在此位置上 等电点相同的蛋白质都聚焦在与等电点相同的pH位置上 + - pI pH14 pH1

61 SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂 ，带大量的负电荷 SDS与蛋白质结合，其所带负电荷大大超过蛋白质所带电荷量，消除了不同蛋白之间所带电荷的差异 SDS-PAGE中，蛋白质迁移率只与蛋白质的分子量有关

62 先根据蛋白质的等电点不同，利用等电聚焦进行第一向分离，将等电点相同的蛋白质集中在与等电点相同的pH区
再以与等电聚焦成90度角的方向进行SDS-PAGE第二向分离，将等电点相同的蛋白质再按分子量大小彼此分开 以此将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上以点的形状分离。

63 蛋白质双向凝胶电泳是各种蛋白质分离分析方法中唯一能同时分辨上千个蛋白质点的技术
蛋白质组学研究中主要的分离技术

64 （二）、双向凝胶电泳技术操作的基本过程 提取蛋白样品，进行样品的预处理 进行第一向等电聚焦电泳 等电聚焦后的胶条经过平衡
转移到第二向凝胶上，与等电聚焦呈垂直方向进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 用银或考马斯亮蓝染色，经双向凝胶电泳图像分析软件进行凝胶图像分析 找出差异表达的蛋白质点

65 （三）、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题
1.双向凝胶电泳结果的可重复性 蛋白质样品制备是关键 1）.尽可能地使蛋白质组中的各种蛋白质成分都溶解在裂解液中 2）. 防止制备过程中蛋白成分的降解与修饰 3）. 要保证蛋白质彻底变性 4）.取材要有重现性：用细胞 不用组织

66 激光俘获显微切割技术（laser capture microdissection，LCM）特异的从组织中分离出某一种细胞，可以高通量、高精度、迅速的得到组织来源的某一种细胞。

67 5）裂解液中需加： 尿素断裂蛋白质的氢键和疏水键 还原剂破坏蛋白质中的二硫键 兼性离子去垢剂增加疏水性氨基酸残基的溶解性 6） 整个制备过程需在低温环境中进行，在裂解液中加入蛋白酶抑制剂

68 用固相pH梯度等电聚焦（IPG） 防止阴极飘移，pH 梯度不稳定 载体两性电解质在电场中依据其等电点形成pH梯度，这种pH梯度因阴极飘移而不稳定，缺少重现性。 IPG中的pH梯度是凝胶聚合过程中通过酸性和碱性丙烯酰胺缓冲液形成的，是稳定的 双向电泳中的等电聚焦选用IPG

69 2． 凝胶中蛋白质的染色 同位素 同位素是目前已知最灵敏的蛋白质染色方法 同位素是在细胞代谢过程中掺入蛋白质的，不同蛋白质掺入的同位素量不同，因此同位素强度不能代表蛋白质的实际丰度 同位素标记的蛋白质不能直接用于后续的鉴定实验

70 银染色 银染色是除同位素外最灵敏的染色方法 只需1～10ng蛋白质即可显示出条带。 酸性的硝酸银染色法更适合酸性蛋白的染色， 碱性的银氨染色法对碱性蛋白质的灵敏度稍高

71 双向电泳的染色（银染）

72 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷，考马斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝 R-250比G-250的灵敏度稍高，100ng左右蛋白质即可显示出条带，G-250更适合染色小分子多肽 方法简便，是最常用的染色方法 脱色后的蛋白质样品可用于质谱分析等后续研究

73 双向电泳的染色（考马斯亮蓝染色）

74 非共价修饰的荧光染料 如Sypro red 和Sypro orange 灵敏度可与银染媲美 方法简单，一步染色，无需脱色 样品可直接用于序列测定和质谱分析

75 锌、铜负染 凝胶背景为不透明的乳白色或青绿色，蛋白斑点则是透明的 灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间 染色对后续分析的干扰较小

76 目前在蛋白质组研究中经常将两种染色方法结合使用
先经银染分析确定有意义的蛋白斑点，再加大上样量，重作电泳，用考马斯亮蓝染色 纯化的样品经脱色后进一步进行质谱鉴定

77 差异凝胶电泳（Differential gel electrophoresis）

78 3．凝胶中蛋白质点的检测与鉴定 测定蛋白质点的分子量、等电点和表达丰度 凝胶用银染色 计算机扫描凝胶图像 用计算机软件直接处理

79 确定图谱中有无特定的蛋白质 凝胶中蛋白质转印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidence difluoride， PVDF）膜上， 与特异性的抗体反应，方法同Weaterb bloting。

80 确定蛋白质点的结构和功能 借助生物质谱技术 肽指纹图谱（Peptide mass fingerprinting, PMF）
用识别特定序列的蛋白酶水解蛋白质 基质辅助激光解吸电离子飞行时间质谱分析 多肽图谱 由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，图谱具有特征性，称为指纹图 图谱与蛋白质库比对，确定结构和功能

81 肽序列标签串联质谱鉴定技术测定蛋白质的氨基酸序列
蛋白质由20种氨基酸组成。 4肽中氨基酸的可能排列顺序就有204，一个特定序列的4肽出现的频率是1/160000。 一般测出蛋白质氨基端4个氨基酸序列已完全可以满足蛋白质鉴定的需要。

82 质谱只能测小分子多肽序列 将肽指纹图和序列结合，与数据库比对 确定蛋白质结构和功能 新发现蛋白质测全部序列

83 4．蛋白质双向凝胶电泳技术存在的不足 低拷贝蛋白的表达量低，用现有的染色方法可能显现不出来 人体内的低拷贝蛋白往往是重要的调节蛋白，在体内数量虽少，生理作用较大

84 极酸极碱性蛋白质，极大或极小蛋白用双向凝胶电泳分离还比较困难
难溶蛋白尤其是一些膜蛋白因其不溶性也不方便用双向电泳分离 对双向电泳分离出来的蛋白质点，目前还缺少真正的在膜上高通量的鉴定技术

85 （四）、双向凝胶电泳技术在医学中的应用 1．寻找疾病的特异标志物
2D技术可把正常或病变的细胞内成百上千个蛋白质分开，找出差异蛋白点。而这些差异蛋白点隐含着巨大的生物学信息，其中一些就是疾病的特异标记物。 2． 研究疾病的发病机制 正常细胞（或组织）与病变细胞（或组织）之间的蛋白质组存在着明显的差异，通过2D电泳技术了解基因表达上的这种差异，可在分子水平上研究相关疾病的发病机制

86 四、双向凝胶电泳技术在医学中的应用 3．耐药机制的研究
多药耐药性与多药耐药相关蛋白有关，双向电泳技术有助于寻找和发现多药耐药相关蛋白 ，研究多药耐药机制 4．新药的开发与药理研究 可将一个细胞或组织的健康和疾病状态的蛋白质组图谱进行比较，分离并鉴定差异表达蛋白质，找出药物作用的特异靶点

87 双向高效柱层析技术 第一向为凝胶过滤层析 机理与双向凝胶电泳的SDS-PAGE相同，按分子量大小进行分离 第二向是反向层析 利用了蛋白质表面疏水作用的差异 与双向凝胶电泳的等电聚焦分离蛋白质原理完全不同

88 双向层析技术可与双向凝胶电泳技术互相补充
双向层析技术与双向电泳比较，优点在于可以适当放大，分离的蛋白质样品可直接进入质谱进行鉴定