优良公猪精液高效利用关键技术 王维洪 ( ) 杭州越丰生物科技有限公司

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1 优良公猪精液高效利用关键技术 王维洪 (13456780666) 杭州越丰生物科技有限公司
专注于动物精液的高效保存 优良公猪精液高效利用关键技术 王维洪 ( ) 杭州越丰生物科技有限公司

2 现 状 公母比例：1∶50—80？ 受胎分娩率：85%？ PSY：20？ 结 果 盲目的扩大规模 目 的 是效益而不是规模
猪场现状 现 状 公母比例：1∶50—80？ 受胎分娩率：85%？ PSY：20？ 结 果 盲目的扩大规模 目 的 是效益而不是规模 专注于动物精液的高效保存

3 人工授精的本质 产生的误区： A——只需人工授精就可提高产仔数 B——精液越新鲜越好，超过3天宁愿倒掉也绝不使用
人工授精的本质是什么？ 我的理解：高效率（益）地使优良公猪的遗传潜力在后代中发挥 产生的误区： A——只需人工授精就可提高产仔数 B——精液越新鲜越好，超过3天宁愿倒掉也绝不使用 C——不去认真掌握人工授精技术的各个细节 专注于动物精液的高效保存

4 人工授精的本质 专注于动物精液的高效保存

5 结 果 如何生产优质精液？ 问题一：优良公猪+优质精液生产 从优良公猪中间去大量生产优质精液 1、何谓优良公猪 2、育种 3、引种 1、品种
如何生产优良公猪？ 1、何谓优良公猪 2、育种 3、引种 如何生产优质精液？ 1、品种 2、营养 3、精液生产过程 结 果 从优良公猪中间去大量生产优质精液 专注于动物精液的高效保存

6 问题二：如何利用优质精液 专注于动物精液的高效保存

7 精 子 一、精液的化学成分 精液的化学成分受采精方法、时间、采精频率等许多因素影响而变化很大。主要包括水分；钠、钾、钙、镁、氯、磷等微量元素；氨、氮、尿素、尿酸等代谢物；麦硫因、果糖、山梨醇、肌醇、柠檬酸、乳酸、甘磷酰胆碱、蛋白质等有机物。其成分含量因变化大不罗列了，如钠的含量可从290mg/ml持续到850mg/ml。其成分在不同部位（射出的精液、附睾和精囊腺分泌物中）含量也相差很大。在此不具体列举。 二、精液的生物物理学特性 （1）渗透压：精液在一定条件保持其一定范围的渗透压。精子和精清间是等渗的关系。为保存精液，如果稀释液渗透压较高或低于精液，就会破坏这一等渗状态，严重时就会损害精子。精液的渗透压用摩尔浓度表示。 （2）PH：猪精液呈弱碱性，PH为7.5，范围为7.3—7.9。在附睾内的精子处于弱酸性，精子呈休眠状态，射精后因有副性腺分泌物碱性盐的中和，使精液PH上升。 （3）相对密度：精子相对密度大于精清。正常值为1.023。 （4）其他特性：包括透光性、导电性和黏度等性状。 专注于动物精液的高效保存

8 受 精 卵子 精子 一、受精前的准备 二、受精过程 精子穿过放射冠——顶体反应 精子穿过透明带—透明带反应 精子进入卵黄——专一性
受 精 一、受精前的准备 二、受精过程 精子 运行：射入子宫的精子2h后到达子宫与输卵管连接部，可持续24h，从管口到壶腹部需要15—30min，可持续24h。 获能：必须经过一定时间在形态与生理生化方面的变化后才有受精能力。获能后的精子释放水解酶溶解细胞间质，同时顶体脱落，露出穿孔器，穿越卵母细胞的透明带。 卵子 运行：从卵巢快速通过壶腹部，并在壶峡部停留2天。在输卵管内的运行时间也为50h。 “获能”：成熟过程与精子类似，维持受精能力的时间为8—10。到达受精部位后如果没有精子与之受精，则继续运行并衰老。 精子穿过放射冠——顶体反应 精子穿过透明带—透明带反应 精子进入卵黄——专一性 雌雄原核形成，进而形成配子。 专注于动物精液的高效保存

9 二个重要环节 稀释保存 检 测 专注于动物精液的高效保存

10 精 液 稀 释 保 存 精液稀释的目的：一是增加精液量；二是延长精子的寿命，增加保存时间。
1、精液采集后应尽快稀释，原精贮存不超过30min。 2、未经品质检查或检查不合格（活力0.7以下）的精液不能稀释。 3、稀释液与精液要求等温稀释，两者温差不超过1℃，即稀释液应加热至33℃～37℃，以精液温度为标准，来调节稀释液的温度，绝不能反过来操作。 4、稀释时，将稀释液沿盛精液的杯（瓶）壁缓慢加入到精液中，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌，使之混合均匀，不能反过来操作。 5、如作高倍稀释时，应先作低倍稀释（1：1-2），待半分钟后再将余下的稀释液沿壁缓缓加入。 6、稀释倍数的确定：要以每个输精剂量含有效精子数30亿以上，输精量为80mL来确定稀释倍数。 7、稀释后要求静置片刻再作精子活力检查，如果稀释前后活力无太大变化，即可进行分装与保存；如果活力显著下降，不要使用。 8、混合精液：新鲜精液首先按1：1稀释，根据精子密度和混合精液的量记录需加入稀释液的量，将部分稀释后精液放入水浴锅保温，混合2头以上公猪精液置于容器，加入剩余部分稀释液（要求与精液等温），混合后再进行分装。 专注于动物精液的高效保存

11 猪常温稀释保存剂的概念 猪常温稀释保存剂是指在常温条件下（一般指16～18℃）用于稀释和保存猪合格精液的由专用配方配制而成的制剂。以使稀释保存后的精液还能用于猪人工授精（即稀释后的精液还达到国家关于精液生产的标准）中。 需要强调的是三点：常温条件、合格原精和专用配方。 专注于动物精液的高效保存

12 常温稀释保存剂的作用 在公猪精液中加入稀释保存液的作用在于供给精子足够的营养并防止精子逐渐冷却和行缓冲作用时PH值的变化以及维持正常的渗透压，离子和电解质的平衡等。 其目的有二：一是增加精液量，仅用5%葡萄糖溶液就可，不宜用作保存。二是用以保存精液。其保存时间短效者可保存1-3天，长效者可保存1-7天。目前已开发出可保存7-15天之超长效稀释保存液。保存时间越长，其包含的成分也越复杂。 需要强调的有二点：营养和保存时间。 专注于动物精液的高效保存

13 常温保存剂的配方构成 猪用常温保存剂的配方构成分为三大部分：一是提供能量，以使精子能处于休眠而不是死亡；二是维持渗透压的平衡，以使精子在休眠阶段尽量不致畸形；三是维持酸碱度的平衡，确保精子生存环境不出现剧烈的变化。此外，为了保证精液在体外环境中不受病原微生物的污染，还需要加入合适的抗生素或有同样作用的物质。 专注于动物精液的高效保存

14 猪精液常温保存剂的研发历程 自从上世纪40年代猪人工授精技术广泛应用以来，诸如俄罗斯、日本、欧美等国的学者就开始猪常温稀释保存剂的研发，并逐渐商业化。但直至90年代，都没有找到保存时间能超过3天的有效技术和配方。 在我国，80年代初有专家学者及生产技术人员开始关注猪常温稀释保存剂的研究及应用。但基本上都是建立在国外的研究和应用基础之上的。 90年代后，随着人工授精技术的进展和药学、化工、机械设备技术的进步，猪常温稀释保存剂的研发也取得了长足的进步，尤其是进入新世纪后，保存时间超过7天的长效稀释粉也研制成功，从而使猪人工授精技术在生产上得到了普遍应用。 专注于动物精液的高效保存

15 长效稀释粉在实际使用中的意义 一、什么是长效稀释粉？ 在通常意义上的理解，长效稀释粉是指合格猪精液在使用长效稀释粉稀释后能在常温下（一般指16～18℃）保存7天以上，精液的活力还能达到输精的标准（参照GB/T 25172一2010猪常温精液生产与保存技术规范）。 二、长效稀释粉与其他稀释粉的区别 长效稀释粉在配方组成上，除了一般稀释粉都有的的葡萄糖和柠檬酸外，还添加了Tris（三羟甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，是一种能在加入少量酸或碱和水时大大减低 pH 变动的缓冲溶液 ），氨基酸和有助于保持精子顶体完整性等物质，不仅能有效防止精子在体外降温过程中造成的损伤，而且有助于在使用时提高精子顶体穿透卵母细胞壁的能力。也就是说，在理论上，使用长效稀释粉比一般的稀释粉能有助于提高受胎率或产仔数。 专注于动物精液的高效保存

16 长效稀释粉在实际使用中的意义 三、猪场内使用长效稀释粉的实际意义
在猪场内使用长效稀释粉，不仅可以减少公猪的饲养量，更大意义上是可以充分利用优良公猪的基因，提高猪场的生猪质量，从而提高经济效益。在以前由于市场上较少有稳定的长效稀释粉面市，所以，导致了猪场产生没有普遍使用长效稀释粉的误区，随着稳定的长效稀释粉产品的面市，规模猪场特别是种公猪站应用长效稀释粉就显得十分的有意义，可最大限度地提高配种经济效益，对推动我国种猪生产水平（也即猪的育种）的提高也有极大的帮助。 专注于动物精液的高效保存

17 长效稀释粉在实际使用中的意义 全国生猪遗传改良计划(2009年~2020年)中明确指出:
遗传改良计划的主要任务之一是：推广普及猪人工授精技术，将优良种猪精液迅速应用到生产一线，改善生猪生产水平。国家生猪核心育种场应严格执行场间遗传交流计划，按要求选用其他核心育种场测定优秀的种公猪精液，开展持续性能测定和群体选育工作，建立持续的遗传联系。 为完成上述任务，优秀公猪的精液在场间的交流将会常态化，而我国地域分布辽阔，传输时间跨度将会达到5天以上，因而，长效稀释粉将会无可争议地被各核心猪场使用。 专注于动物精液的高效保存

18 “越丰”长效稀释粉在生产实际使用效果 “越丰Ⅰ号”长效稀释粉于2005年研发成功，并于2007年在配方和工艺上作了进一步的完善，历时多年。在这多年的推广应用中（全国市场上大约有几百万包的“越丰Ⅰ号”长效稀释粉被应用），据不完全统计，相对于其他的稀释粉（短效或其他品牌的长效粉），受胎率提高至少在3%以上，产仔数提高至少在0.2头以上（数据没经数理统计分析，只是一种客观应用统计）。 专注于动物精液的高效保存

19 “越丰”稀释粉的三个国内首创 首创：首个制订了稀释粉的生产标准 首创：国内首个建成并投产的稀释粉十万级 GMP生产车间。
首创：国内首个攻克了热降解的产品，热稳定 性在同类所有产品中居首。 专注于动物精液的高效保存

20 “越丰”稀释粉生产标准 专注于动物精液的高效保存

21 “越丰”稀释粉生产标准 “越丰”稀释粉生产标准的内容： 产品外观 指标 产品储运标准 保存剂标准 产品外包装标准 服务标准 生产工艺 标准
质量检测指标 专注于动物精液的高效保存

22 “越丰”稀释粉生产标准 《“越丰”稀释粉生产标准》封面影印本 专注于动物精液的高效保存

23 越丰10万级GMP稀释粉生产车间 由于影响精液保存的因素很多，促使保存剂在生产过程中对每个影响因素都要进行严格控制。这需要有一个GMP车间来作为其工艺上的保证，而不是大量使用人工的、小作坊式的生产方式所能达到的。 GMP生产车间包括按GMP要求设计建造的更衣消毒设施、生产车间（包含有自动称重设备、自动包装）、分析检测室、成品库等。 专注于动物精液的高效保存

24 越丰10万级GMP稀释粉生产车间 车间整体 专注于动物精液的高效保存

25 “越丰”稀释粉热稳定性 保存剂的热稳定性对保存剂的运输及使用有着重要的影响。当保存剂出现热稳定性变差时，会使其在运输与保存时发生热降解如变黄、结块等，那么其所含的PH稳定剂的降解产物会改变精密配比的缓冲体系的抗酸碱能力，也即使保存剂对于精子代谢产物的缓冲能力减弱，影响精子顶体和生物膜的完整性；另一方面，抑菌物质发生热降解会导致有毒有害物质产生，不仅丧失应有的抑菌能力而且对于精子细胞会产生较大的毒性，会导致受胎率的下降。 专注于动物精液的高效保存

26 “越丰”稀释粉热稳定性 热稳定性 抗结物质 低透氧率 生产环境
“越丰”稀释粉依托GMP车间先进的生产工艺、结合世界领先的干燥技术，达到了非常良好的热稳定性。 生产环境 抗结物质 热稳定性 低透氧率 杜邦膜干燥剂 专注于动物精液的高效保存

27 “越丰”稀释粉热稳定性 专注于动物精液的高效保存

28 完善配种之检测 检测 原精检测 检测仪 稀释后检测 使用前检测 数据记录 分析 专注于动物精液的高效保存

29 优 点 1、成本廉价？ 2、灵活与应变？ 缺 点 1、心情影响 2、疲劳 3、标准的摇摆 结 果 使用检测仪可大大提高生产效率（益）
人工检测的优缺点 优 点 1、成本廉价？ 2、灵活与应变？ 缺 点 1、心情影响 2、疲劳 3、标准的摇摆 结 果 使用检测仪可大大提高生产效率（益） 专注于动物精液的高效保存

30 精液质量检测系统 显微镜 摄像装置 精子计数板 恒温系统 计算机分析软件 专注于动物精液的检测

31 显微镜1 1、使用平场消色差物镜 2、使用LED照明
  消色差物镜对球差的校正限于黄绿光范围内，对色差只校正红、绿光，用消色差物镜时仍有残余色差，像域弯曲仍然存在。 与消色差物镜相比，平场消色差物镜使像域弯曲得到很好的校正。最好的物镜就是平场消色差的，用平场消色差物镜时图像边缘会更清楚一些。平场消色差物镜相对于消色差物镜，清晰范围更大。 2、使用LED照明 1）没有频闪：因为LED灯为纯直流供电，无频闪，不易使眼睛产生疲劳感，亦不会对工作区域的其它设备产生谐波干扰。在连续采集中各图像照明均匀，提高检测精度。 2）光照均匀：LED均匀照射在被观察物体上，无虚影产生，清晰度高。提高精子图像的清晰度。 3）超长寿命：LED光源由于发热量低(没有热幅射)、耗电量小，平均寿命大于35000小时，热幅射对检测精子的运动状态的影响有待研究。 4）亮度可调：可根据自身对亮度的适应性随意调节亮度，使之达到最为理想的舒适度，线形效果非常理想，使长时间工作的眼睛不易产生疲劳感。 5）可使用电池供电，方便携带，可在无电网状态工作。 专注于动物精液的检测

32 显微镜2 3、无限远校正光学系统 4、相差装置、 显微镜在检测系统中是重要的组成部分。图像质量取决于显微镜的选择。
无限远校正光学系统中，由标本通过物镜的光线不在物镜成像，而是作为无限远的平行光束进入成像透镜，由成像透镜形成中间像。而在有限远校正光学系统中，则由物镜单独形成中间像。无限远校正的光学系统中，物镜与成像透镜之间为平行光线，原理上具有下述优点：改变物镜与成像透镜的间隔，倍率不会改变。物镜与成像透镜之间插入平行平面板，也能保持齐焦，成像不会偏移。此处列举的两个优点，在显微镜光学系统的构成上也非常有益，因此，一直存在着“无限远校正光学系统是理想的显微镜光学系统”这一说法。如果能最大限度的利用该优点，就可以在物镜和成像透镜之间的平行光束部分中自由插入或移去中间镜筒，构建最佳的光学系统。例如奥林巴斯CX21和CX31就是采用无限远校正光学系统。 4、相差装置、 相差显微镜（phasecontrast microscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。 显微镜在检测系统中是重要的组成部分。图像质量取决于显微镜的选择。 我司生产的精液质量检测系统可根据客户需求配置不同的显微镜。 专注于动物精液的检测

33 摄像装置 1、采集卡+模拟摄像机 摄像机采集图像输出模拟信号给采集卡，由采集卡转换成数字图像信号。该采集系统每秒可达25幅图像，采集速度快，成本较低。图像分辨率为768*576。 2、数字摄像机 我司开发的HView 5MC数字摄像机，最高像素达到500万像素。在动态分析时，为了实现高速摄像，实现每秒30幅以上的图像（计算机速度、曝光时间影响），分辨率为1280*960的像素（120万像素）。在形态分析时实现2592*1944像素（500万像素），真正实现数字高清。 3、比较 HView 5MC数字摄像机采用逐行扫描技术，有别于模拟摄像机，模拟摄像机采用隔行扫描。逐行扫描相对于隔行扫描是一种先进的扫描方式，它是指图像进行扫描时，从CCD霸面左上角的第一行开始逐行进行，整个图像扫描一次完成。因此图像显示画面闪烁小，显示效果好，隔行扫描在精子的高速运动易产生“锯齿”。如果数据采集速度慢，逐行扫描的CCD拍摄动体也会出现扭曲，反之，如果数据采集速度足够快，隔行扫描也没有什么问题。       所以，尽管从技术层面来讲逐行扫描CCD是好一些，但从相关资料了解到，由于同样大小CCD像素的不断增加，CCD显微摄像头中传送信号的通路无法适应逐行扫描得到的一次性的大量的数据，会造成图象处理速度的下降。 专注于动物精液的检测

34 精子计数板 1、HView精液检测系统专用精子计数板 2、Makler精子计数板 3、国产精子计数板 4、血球计数板 5、载玻片
使用进口精子计数板，盖玻片带刻度，最小刻度为0.1mm，每片计数板有2个计数池，计数池深为10um。 由于正常猪精子头部大小为6.55×3.47um，10um的计数池深适合猪精子在计数池中自由运动，又不产生分层现象。更能准确计算密度和活率。 该计数板的透光率远远强于国产的精子计数板。 计数板经过清洗、干燥后可重复使用，降低精液检测的成本。 2、Makler精子计数板 10 microns标准深度，有效消除斑点干扰，精子可以自由游动，可以观察到一个焦平面的图像。成本高。 3、国产精子计数板 液面深度不能保证，透光率低。部分使用一次性精子计数板的成本高。 4、血球计数板 每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。 5、载玻片 液面深度不能保证，不适精液检测系统使用。 专注于动物精液的检测

35 检测恒温系统 精液的预恒热、精子计数板的预热、检测台面的恒温组成完善的检测恒温系统。
精子活力的测定：精子的活力是指原精液在37℃下呈直线运动的精子占全部精子总数的百分率。测定方法是将一滴原精液滴在一张加热的计数板上，显微镜工作台的温度应保存在37℃，一般地，鲜精活率应在80%以上，当活率低于40%时精液不可再用于输精。 由于精子的活力受环境条件的影响很大，为了得到客观、准确的结果，在评定时应注意如下方面：检查活力时应保存在恒温条件下进行；不要让阳光直接照射到精液样品上；远离易挥发的化学物质或消毒剂。 专注于动物精液的检测

36 我司于2011年获得国家创新基金的扶持。专注于动物精液的检测软件的开发，并于2014年初通过国家验收。
计算机分析软件 显微镜、摄像装置、精子计数板、恒温系统均影响计算机软件分析结果。 我司于2011年获得国家创新基金的扶持。专注于动物精液的检测软件的开发，并于2014年初通过国家验收。 几年间公司产品销往北京、山东、浙江、福建、广东、广西、云南、贵州、四川、武汉、河南、河北、辽宁、新疆、江苏、安徽、湖南、湖北、海南、江西等城市和省份，获得用户的一致好评。在听取用户的意见后，我司删除了一些不实用的功能模块，使得软件更贴近用户的实际需求，操作更加简便。为了使该项目产品分析更加准确，在2013年底，公司推出了数字高清版和数码版，数字高清分辨率达到1080P，每秒采集速度30帧，图像更清晰，精子的运动跟踪更加准确；数码版的产品USB供电，最高像素达到500万像素，在1280×960分辨率下实现30帧的采集速度，该产品使用逐行扫描，减少了隔行扫描产生的误差，使分析结果更加准确。为了满足部分客户的移动、无需电源的要求，公司推出了手提电脑版，配合配置LED、锂电池显微镜使用；使用户在人工受精前，无论在何处均可使用该项目产品。 专注于动物精液的检测

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