第十章 重组DNA技术 DNA Recombination Technique

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1 第十章 重组DNA技术 DNA Recombination Technique
分子生物学与生物信息学系 李莉云 (O) B-2416, 2425 QQ

2 本章主要内容 基因克隆的原理 核酸的提取和检测 核酸的分子杂交 PCR技术 基因文库的构建 基因表达

3 10.1 重组DNA技术的原理 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件 然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。

4 基因工程的操作过程 重组DNA导入受体菌 酶切 连接 转化 扩增 检测 目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
克隆基因的表达 转化子的筛选和鉴定

5 目的基因的克隆 基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：
一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。

6 10.2 核酸的提取及检测 就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。
10.2 核酸的提取及检测 就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 兰A；红B；绿Z

7 10.2.1 基因组DNA的分离与纯化 DNA主要存在于细胞核的染色体中。
核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则 保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染

8 一般步骤 (1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂）
EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶 (2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA SDS阴离子去垢剂作用： 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 对RNase、DNase有一定的抑制作用。

9 10.2.2 cDNA的分离与纯化 （1）mRNA 分离 RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 —DEPC(焦碳酸二乙酯 —异硫氰酸胍 Trizol试剂 提问：什么是cDNA？

10 （2）The first strand synthesis

11 （3）The second strand synthesis
cDNA第二链的合成方法－ 自身引导法

12 自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割
发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5’端序列 出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。

13 cDNA第二链的合成方法－置换合成法 利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。 从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。 注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH （降解DNA/RNA中的RNA）活性。

14 cDNA第二链的合成方法－置换合成法 该方法使用较多 5‘ppp’5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
DNApol dNTPs RNaesH 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4-DNA ligase 该方法使用较多

15 10.2.3 质粒DNA的分离与纯化 质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位 共价闭合环状
质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离

16 质粒DNA－碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。 实验内容在第6学期的《生物技术大实验》中进行

17 10.2.4 核酸的检测 包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法 dsDNA：1A260≈50ug/ml
核酸的检测 包括DNA的质量、大小、纯度检测 分光光度计法 dsDNA：1A260≈50ug/ml ssDNA，RNA：1A260 ≈ 40ug/ml 寡聚核苷酸：1A260 ≈ 20ug/ml A260/A280 ＝ 1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染（why?） 凝胶电泳法

18 凝胶电泳技术 样品的物理性质 分子大小、电荷、空间构型 支持物介质 琼脂糖，100-60000bp, 聚丙烯酰胺，1-500bp
电场强度，5V/cm 缓冲液离子强度 TAE, TBE, TPE

19 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶 分辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小(bp) Agarose ~1000 ~1000 ~300 PAG ~100 ~25 ~1

20 指示剂 溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应 便于加样 监视实验进行 染色剂 溴化乙锭EB 吖叮橙 EB可检测到ng级的DNA，
（在1％胶中，Bb迁移率约0.6kb，Xc约2kb） EB可检测到ng级的DNA， 荧光强度与DNA数量成正比

21 操作过程

22 DNA分子大小的检测 提问：如何用琼脂糖凝胶电泳技术确定质粒DNA的大小？
PCR产物 3Kb 1Kb 对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。 能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量? 不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。 NEB，1Kb DNA Ladder：3kb=62.5ng， 1kb=21.0ng 提问：如何用琼脂糖凝胶电泳技术确定质粒DNA的大小？

23 10.3 核酸的分子杂交 杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链
10.3 核酸的分子杂交 杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链 E.Southern，1975

24 分子杂交的特点和应用 杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成 杂交过程高度特异性，检测方法高度灵敏
杂交双方是待测核酸序列及探针 用于基因克隆的筛选

25 Southern blot

26 Northern blot

27 菌落原位杂交

28 荧光染色体原位杂交 (Fluorescence in situ Hybridization；FISH)
基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。

29 10.4 PCR技术 The polymerase chain reaction
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程 就是一个PCR循环，PCR就 是这种循环的不断重复。

30 PCR原理 请注意引物结合的位置 作业：请用示意图画出PCR的2个循环过程，标明序列方向

31 PCR用于疾病检测 a-地中海贫血症是一种遗传性的血红蛋白合成紊乱的疾病，特点是成人血红蛋白的一条或多条球蛋白链减少或丢失。

32 分子标记技术 分子标记：以生物的某些大分子物质的多态性为基础的遗传标记, DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至是单个核苷酸的变异。 能稳定遗传；不受环境条件影响，不受组织和发育阶段限制；检测方法简单快捷； 也称为指纹 fingerprint

33 各种遗传标记的分子关系 RFLP DNA RAPD 基因型 AFLP RNA 形态性状 Pro 生理生化指标 表现型 细胞学标记 其他性状
受环境条件影响 标记数量有限

34 分子标记的种类 Based on hybridization: RFLP Based on PCR:
RAPD, AFLP, STS，EST，SAGE Based on repeat sequences: Minisatellite DNA，SSR， Based on mRNA: DDRT-PCR, RT-PCR, 作业：写出以上词语的全称和中文名称

35 简单序列重复 SSR，Simple sequence repeat
由2-20bp的核心序列重复成百上千次所组成 侧翼为单拷贝保守序列，据此设计引物。通过PCR扩增出每个位点的序列，电泳 各位点上不同等位基因的重复单位数目是高度特异性的，因此微卫星显示了高度的多态性.

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37 10.5 基因文库的构建 基因文库的概念 基因文库DNA library, DNA bank：用重组DNA技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体DNA的所有片段随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。

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39 基因文库的种类 基因组DNA文库，Genomic libraries : 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；
cDNA文库，cDNA libraries：是指含有所有重组cDNA的克隆群体。

40 基因文库的构建流程

41 10.5.2 目的基因的获取 来源于生物材料： gDNA， cDNA（在10.2中讲过了） PCR反应： 目的基因的（部分）序列已知
目的基因的获取 来源于生物材料： gDNA， cDNA（在10.2中讲过了） PCR反应： 目的基因的（部分）序列已知 化学合成法： 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

42 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

43 10.5.3 用于基因克隆的载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
用于基因克隆的载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 常用载体：质粒载体，噬菌体载体， BAC 克隆载体，表达载体

44 载体的基本特点 能自主复制； 具有一个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

45 质粒载体 ori 复制起点 MCS 多克隆位点 Ampr 氨苄青霉素抗性基因 LacZ’ β-半乳糖苷酶基因的部分序列 P 启动子
PT7 ori PSP6 pGEM3z 质粒载体 ori 复制起点 MCS 多克隆位点 Ampr 氨苄青霉素抗性基因 LacZ’ β-半乳糖苷酶基因的部分序列 P 启动子

46 噬菌体载体 由野生型噬菌体改建，消除或改变基因组必须区内的不必要的酶切位点

47 粘粒载体，柯斯质粒（Cosmid）

48 人工染色体 人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。
原理：天然染色体基本功能单位包括复制起始点（ARS）、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。ARS保证染色体复制，CEN保证染色体分离，TEL保证染色体的稳定存在。人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连接起来，从而构成了人工染色体。 酵母人工染色体YAC，细菌人工染色体BAC

49 YAC 酵母人工染色体 容载能力大 350-1000kb 存在嵌合现象，即一个YAC克隆中的DNA片段可能来自两个或多个不同的片段
转化效率低

50 BAC 细菌人工染色体 细菌人工染色体是由大肠杆菌单拷贝F质粒衍生而成 100-350kb 遗传稳定性高， 易转化，嵌合及 重组现象少
BIBAC, 双元细菌人工染色体 TAC，可转化人工染色体

51 载体的结构与特点小结 名称 受体细胞 结构 插入片段 举例 质粒 E.coli 环状 <8kb
pUC18/19，T-载体, pGEM3z λ噬菌体 线状 9-24kb EMBL，λgt系列 丝状噬菌体及噬菌粒 <10kb M13系列 粘粒载体 35-45kb BAC 约300kb pBeloBAC 11 PAC kb PCYPAC YAC 酵母细胞 线性 kb MAC 哺乳动物细胞 >1000kb

52 DNA的体外重组

53 限制性核酸内切酶 5‘ … … 3’ 3‘ … … 5’ EcoRⅠ 回文序列 palindromic seq

54 粘性末端 cohensive end 平末端 blunt end Sma I CCCGGG GGGCCC CCC GGG

55 DNA连接酶（DNA ligase） DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。

56 限制性内切酶识别的靶序列与DNA的来源无关，任何不同来源的DNA，经过适当限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐末端连接起来，这是DNA重组技术的基础

57 10.5.5 重组DNA分子的转化 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。
转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

58 阳性克隆的筛选和检测 目的基因 载体 限制性内切酶 DNA连接酶 载体自连 目的基因自连 重组体

59 阳性克隆的检测方法 抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序 - - -

60 BamHⅠ 抗药性标记选择 (插入失活法)

61 蓝-白筛选（α互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码信息（LacZ’）。这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。 宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。 提问： β-半乳糖苷酶的作用？乳糖操纵元的结构？

62 乳糖操纵元 LacZ基因编码半乳糖苷酶 分解Xgal→Blue product LacZ’ 复习
β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成 LacZ基因编码半乳糖苷酶 分解Xgal→Blue product LacZ’

63 α互补的检测

64 10.5.7 基因文库的应用 建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。
基因文库的应用 建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。 如果一个哺乳动物的基因组是 3×109碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的 DNA片段在技术上是很困难的。但是在基因文库中，不同的 DNA片段都分别在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简单的工作。　

65 基因组文库与cDNA文库 小结 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 

66 课堂讨论 已经构建了某生物的基因组文库，是否还有必要构建其cDNA文库? 为什么？
某实验小组获得了GAPDH的cDNA，是否等于得到了该基因？为什么？

67 10.6 克隆基因的表达 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。

68 表达载体

69 GST P GST，Tag 谷胱甘肽转移酶 融合蛋白质

70 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成
产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素( 1b, 2a,  2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱

71 Cloning of the Human Insulin Gene from a Genomic DNA Library
Phage packaging mix Infectious phages infect cells Plaques Positive hybridization (black spot on autoradiogram shows phage carrying human insulin DNA that was identified by rat DNA) Hybridize to radioactive probe; Autoradiograph; Probe with rat insulin gene Partially digest human cellular DNA into fragments of about 20 kb with EcoR1 and ligate into Lambda phage with EcoR1 sticky ends.

72 restricted DNA autoradiogram
DNA fragment fragment identified by probe Remove desired clone Infect fresh bacterial host Genomic clone used to probe cDNA library; cDNA will be isolated in expression vector a multi-millionaire千万富翁 Manufacture foreign gene. Here one manufactures human insulin, purifies it, sells the product and becomes a multi-millionaire.

73 基因克隆表达 小结

74 本章内容总结 实验技术：核酸的提取和检测 核酸的分子杂交 PCR技术 分子标记技术 基因文库的构建
基本概念：基因克隆，载体，插入失活，蓝白斑筛选 Southern，Northern，FISH, 菌落原位杂交 PCR，SSR 基因组文库，cDNA文库

75 Functional genomics Structural genomics Proteomics
DNA sequencing analysis mRNA transcript Proteome analysis Network analysis DNA chips cDNA arrays Differential display DNA sequencing S.N.P. Gene mapping Positional cloning 2-D gel electrophoresis Mass spcetroscopy Protein chips Yeast two-hybrid Phage display Affinity assay tech Protein chips Systematic gene knockouts Transient gene inactivator