七 思考题 1. MS原理、特点及其MS系统。 2. 四极杆质谱、飞行时间质谱仪原理。 3. 生物质谱的基本原理。

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1 七 思考题 1. MS原理、特点及其MS系统。 2. 四极杆质谱、飞行时间质谱仪原理。 3. 生物质谱的基本原理。
4. 生物质谱的电离方式。 5. 生物质谱的常见类型。 6. 何为串联质谱？CID的离子类型。 7. MS法分析蛋白质及多肽的步骤。 8. MS前样品的制备。 9. 何为PMF？如何应用。 10. 如何应用串联质谱法鉴定蛋白质？

2 第八章 蛋白质组研究中的定量方法 概述 化学标记定量法 蛋白质芯片

3 蛋白质定量分析策略 双向凝胶电泳 (2D-PAGE) 基于胶的差异分析技术 荧光双向差异凝胶电泳 (DIGE) 蛋白质定量差 异分析技术
多维液相色谱-MS分离鉴定系统 ICAT 稳定同位素特征标签生物质谱(SIAMS) iTRAQ 非胶差异分析技术 MCAT (mass-coded abundance tagging) 蛋白质芯片 基于整体蛋白质的质谱差异分析 蛋白质定量分析策略

4 不同染色方法的比较 染色方法 灵敏度(pg) 线性范围 与质谱兼容性 试剂耗费 对软硬件要求 考马斯亮蓝染色 105 μg ++ + 银染
200 ng 荧光染色 400 ng +++ ++++ 荧光标记 250

5 Cy3和Cy5染料的化学结构式

6 Comparison of 2D-DIGE imaging and Sypro Ruby post-staining
Left panel: merged Cy dye image of HB4a lysate labelled with Cy3 (red) and HBc3.6 lysate labelled with Cy5 (blue). The same gel was post-stained with Sypro Ruby (right panel). Circles represent differentially expressed proteins detectable by both methods. Arrows represent spots detected by Sypro Ruby but not Cy-dye labelling. （摘自Journal of Chromatography A, 2004,1051: 3-17）。 Comparison of 2D-DIGE imaging and Sypro Ruby post-staining

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9 ICAT标记方法的步骤: 1. 将来自一种状态下的细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D0试剂标记蛋白质侧链上的Cys残基；将来自另一状态下的同种细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D8试剂标记； 2. 将两种样品混合在一起，用trypsin酶切，产生多肽片段，包括标记的和未标记的； 3. 样品经SCX-RPLC两维色谱分离，除去消化酶、去垢剂、还原剂和ICAT试剂； 4. 混合物经过抗生物素和色谱柱分离，得到只含有同位素标记的多肽混合物； 5. 将分离得到的标记多肽混合物再用RP-μlC-MS分离和鉴定。

10 摘自Current Opinion in Biotechnology 2003, 14:110-118

11 ICAT策略的优点: 1. 若一种蛋白质酶切产生至少一个Cys残基的肽段的话，就可以对其进行鉴别和定量。含有Cys残基的肽段越多，结果对照得出的结论就越准确； 2. 鉴定的肽段中肯定都会有至少一个Cys，因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件； 3. 肽段根据标记情况有选择性地得到了富集，从而减少了下游质谱分析的复杂程度； 4. 分离出来的标记多肽可直接与后面的RP-µLC-MS分析系统在线偶联操作； 5. 可直接对混合样品进行分析； 6. 可对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定，尤其是对膜蛋白等疏水性蛋白质； 7. 可快速找出功能性蛋白质； 8. 无需繁冗的双向凝胶电泳分析分离； 9. ICAT软件及质谱技术平台系统可用于全自动快速鉴定蛋白质。

12 ICAT策略的缺陷： 1. 不能获得不含Cys的肽段，同时翻译后修饰的检出率较低，而酵母细胞中约有10%左右的蛋白质肽链上没有Cys残基，因而得不到鉴定； 2. ICAT试剂的分子质量为500Da左右，相对肽段而言较大，增加了数据库检索算法的复杂性，对于较小片段的修饰可能会影响数据库搜索； 3. 耗时太长，数据存储消耗在表达量没有改变的蛋白质上，而这些蛋白质可能与研究的问题没有太大的关联； 4. 相对于双向凝胶电泳技术，该方法有高分子量偏性。

13 ICAT策略的改进措施： 1. 采用了固相氨基酸同位素标记试剂来代替ICAT试剂；
2. 采用多维LC-MS/MS分析系统，把鉴定和定量分开； 3. 双向凝胶电泳技术与ICAT技术互补结合测定蛋白质在两样品中的相对含量 4. 磷酸化蛋白质同位素标记亲和标签(Phosphoprotein isotope-coded Affinity Tags, PhIAT) 技术。

14 微孔芯片与GPTS (32 glycidoxypropyltrimethoxysilane) 交联剂130℃保温1 h, 使微孔表面激活, 然后将蛋白质底物加到微孔里冰浴反应3h。经1 %BSA阻滞和TBS清洗后, 加入[33P]-γ-ATP与激酶进行反应。在30℃保温30min后, 洗去多余反应物, 最后由特殊的探测器得到反应结果。 （摘自生物化学与生物物理学报 2001,33(5): ）

15 Thank you!