第八章 植物古DNA研究应用.

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1 第八章 植物古DNA研究应用

2 农业考古的主要研究内容 农作物的起源、发展和传播 农业经济形态研究 首要任务是获得植物遗存并进行物种鉴定。

3 传统研究方法 通常在考古遗址中发现的植物遗存可归纳为四大类: 1.大植物遗存(Macroremains)-果实、种子
2.孢粉(Pollen and Spores) 3.植物硅酸体( Phytolith,Plant opal) 4.淀粉粒（Starch Grains）

4 植物DNA研究历史 植物古DNA的研究始于1985年，Rogers等对考古材料中干瘪植物残余古DNA进行了研究，他们从500~44600年前的干种子中获得了一定数量的DNA（0.3~200 ng/mg），此项研究工作为植物古DNA的研究奠定了方法学上的基础。

5 1990年，美国科学家Golenberg等从美国爱达荷州中新世克拉克遗址 (Clarkia Fossil Site，1700~2000万年前）的雷它木兰 (Magnolia latahensis) 化石中提取出古DNA，扩增并测序了820bp的叶绿体DNA rbcL基因片段。

6 1992年，Soltis 等又从同一地点同一时期的落羽松 (Taxodium distichum) 化石标本中得到了长为1320 bp的叶绿体rbcL基因片段说明从1700~2000万年前的植物化石中获得古DNA是可能的，从而验证了Golenberg的研究结果。

7 2004年，Kim等又从美国爱达荷州Clarkia遗址（1700~2000万年前）的木兰属植物Magnolia latahensis化石和鳄梨属植物Persea pseudocarolinensis化石中分别获得了部分ndhF序列 (1528bp) 和部分rbcL序列 (699 bp)。

8 遗传标记的选择 叶绿体DNA（cpDNA） 线粒体DNA（mtDNA）（变异速度慢，很少用） 核DNA（Nuclear DNA ）
1. rbcL 基因编码1 ,5 - 二磷酸核酮羧化酶/ 氧化酶大亚基,该酶催化光合作用中的CO2 的固定. 由于该酶的重要性使rbcL 成为研究的重点对象。 2. 非编码区 trnL-trnF 和 trnD-trnT. 线粒体DNA（mtDNA）（变异速度慢，很少用） 核DNA（Nuclear DNA ）

9 栽培稻的起源与演化 稻属隶属于禾本科稻族 , 稻属含有19个野生种和 2个栽培种。 非洲栽培稻和亚洲栽培稻。 研究焦点
亚洲栽培稻的起源中心？ 籼稻和粳稻的分化？

10 亚洲栽培稻起源地研究 早期，印度被认为是亚洲栽培稻的起源中心（最古老的Mahagara 新石器早期文化遗址中炭化稻谷的年代为(6570±210) BC） 近年来，在中国的长江中下游地区以及淮河地区发现新石器时代的稻作遗址以及炭化古稻, 从而确立了中国作为亚洲栽培稻起源中心之一的地位（至少8500年）。江西万山仙人洞、湖南道县玉蟾岩、湖南彭头山、河南舞阳贾湖。

11 中国栽培稻起源地点 华南起源说-古籍记载自然环境条件 云南起源说-遗传多样性野生稻 长江中下游说-考古发现。
长江中游 - 淮河上游说。即整个黄河以南地区 ,包括淮河、 长江和珠江流域 ,是一个大的稻作农业起源地 ,即南中国水稻起源中心说

12 籼稻和粳稻的分化 亚洲栽培稻是世界上稻米的主要类型，起源于野生稻可分为籼、粳两大亚种。 籼粳稻一源论 籼粳稻二源论
　 籼稻和粳稻的分化 亚洲栽培稻是世界上稻米的主要类型，起源于野生稻可分为籼、粳两大亚种。 籼粳稻一源论 是籼稻由其祖先种驯化而来 ,而粳稻则是由籼稻分化出的一种适应高海拔高纬度地区的栽培类型 籼粳稻二源论 认为水稻 2个亚种各自独立起源于普通野生稻的不同群体 ,因为它们有明显的分化 ,而且它们分别与不同的野生稻有近的同源。

13 籼稻和粳稻的分子差别 Kanno发现籼稻叶绿体DNA比粳稻叶绿体DNA缺失69个碱基对 。
Cordess等进行亚洲栽培稻基因间隔区的RFLP 分析, 证明籼粳稻间有差异。 Yi等对5S rRNA 基因间隔区的长度变异进行了研究, 也发现籼稻和粳稻之间的差异。 在普通野生稻的也发现籼粳分化现象，表明栽培稻的籼稻和粳稻分化之前就已经存在。

14 古代稻作物的DNA研究 1998年，佐藤洋一郎等对距今7000年以前的浙江余姚河姆渡遗址、江苏高邮龙虬遗址出土的碳化米古DNA进行分析，发现遗址中的栽培稻为粳稻类型。 1999年，汤陵华和佐藤洋一郎等又利用此法分析了中国草鞋山遗址各文化时期的稻种类型的古DNA，结果认定该地区古代各时期种植的稻种类型均为粳稻。

15 起源推测 野生稻祖先起源于喜马拉雅山东南麓、唐古拉山山脉和云贵高原, 青藏高原隆起之前, 这里气候湿润, 地势平坦, 植被茂盛, 野生稻的祖先生长并繁衍在这里; 随着青藏高原的隆起, 印度洋季风气候的产生和几大水系的形成, 野生稻的祖先沿着江河顺流而下, 在沿江两岸栖息繁衍, 广泛分布于我国东南部及南亚、东南亚地区. 具有不同生态型和基因型的野生稻种群, 由于自然变异和生态地理的差异产生了不同程度的籼粳分化类型. 在新石器时代人类稻作文化形成和产生以后, 由于人工选择而逐步演化为现今具有籼稻和粳稻2 个亚种的亚洲栽培稻。

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17 小麦古DNA研究应用 小麦 (Triticum aestivum) 是世界上主要的粮食作物之一，近十年来年产量均超过6亿吨。它的起源和进化是许多遗传学家和育种学家一直在研究的课题，针对考古地点小麦进行古DNA研究，可以反映出早期小麦的遗传特征，这将会为小麦的起源和进化研究提供直接的证据。

18 小麦分类 小麦属通常分3系： ①原始的一粒小麦，为2n=14的2倍体植物，具AA组染色体，小穗含1枚谷粒。
②二粒小麦，小穗含2枚谷粒，染色体为AABB组，2n=28的4倍体植物。一粒小麦和二粒小麦的杂交种是不育的。 ③栽培的普通小麦，小穗含谷粒3～5（～9）枚，系由山羊草属、广义的冰草属和小麦属3个属的种类杂交形成的，染色体组为AABBDD是2n=42的异源6倍体植物。

19 英国曼彻斯特大学的Brown等就一直从事小麦的古DNA研究，他们在1993年的文章中指出：小麦的驯化过程涉及3个不同的倍性以及众多的经济种；在其栽培历史的前8000年中表现出很高的遗传多样性，但在最近1500年中小麦的遗传多样性逐渐减少，逐步形成一个种，大约在100多年前这个种的基因库基本稳定下来。

20 Brown等还对英国和约旦的共3个考古地点采集的小麦种子进行了古DNA分析，他们对这些样本的一段246bp的HMW（high-molecular Weight）谷蛋白前导区序列进行了PCR扩增，其中只有采集自英国Danebury铁器时代考古地点的斯卑尔脱小麦 (T. spelta ) 样本获得了PCR产物。这些Danebury碳化小麦的外观不同，一些麦粒保持原有形状，而另一些麦粒已经变形；种子的颜色也有一个变化范围，并不是所有的都显现碳化种子的灰黑色。他们认为：只有那些原有形态保持不变的种子才保存了足够的古DNA。

21 1998年，Schlumbaum等也成功地鉴定了六倍体小麦。他们在瑞士苏黎世湖旁一个距今约6000年的新石器遗址中发现了大量小麦，从其麦穗轴中成功地扩增出HMW谷蛋白前导区序列，经比较与现代六倍体小麦的相应序列吻合，然而，对同一考古遗址的小麦麦穗轴进行形态学鉴定，又显示其为四倍体裸粒小麦，因此，他们认为这些小麦遗存应为四倍体和六倍体共存。

22 1999年，Allaby等从3000年前希腊Assiros考古遗址的小麦中提取到古DNA，这些小麦遗存可能是栽培二粒小麦 (T
1999年，Allaby等从3000年前希腊Assiros考古遗址的小麦中提取到古DNA，这些小麦遗存可能是栽培二粒小麦 (T. dicoccum) 和斯卑尔脱小麦 (T. spelta) 的混合，可以对其进行鉴别。 2002年，Blatter等研究了来自于瑞士的300年前的斯卑尔脱小麦 (T. spelta) 和250年前的普通小麦 (T. aestivum)，扩增测序了HMW谷蛋白的部分前导区序列。 2002年，Bilgiç等对安纳托利亚的古代样本8000年前的Çatalhöyük和4000年前的İmamoğlu Höyük的古DNA进行了提取、扩增和测序，发现Çatalhöyük中一个类似斯卑尔脱小麦的序列，先前其被认为是单粒和二粒小麦，现在被重新鉴定为六倍体小麦。

23 大麦的起源研究 Barley (Hordeum vulgare ssp. vulgare)被认为是在距今10，500年前在近东地区起源的。
Daisuke等对250种小麦的5个基因Bmy1, bah45n12, GSP,G3PDH 和Waxy进行了DNA分析，发现欧洲和亚洲大麦截然不同。

24 Bmy1 bah45n12

25 GSP G3PDH

26 Waxy

27 2.在远东，可能在伊朗高原的东部边缘，在新石器革命时期扩散到南亚和东亚。
大麦有两个起源地点 1.近东地区 2.在远东，可能在伊朗高原的东部边缘，在新石器革命时期扩散到南亚和东亚。 Genetics

28 玉米古DNA研究应用 玉米 (Zea mays ssp. mays) 是由一种野生草本植物——墨西哥类蜀黍驯化而来的，目前最早的驯化玉米的考古学证据是6250年前 。

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30 1991年，Rollo等采用多种方法研究了前哥伦比亚时期考古地点玉米的古DNA，发现古DNA的含量较少且高度片段化（片段长度都不超过140bp），尽管如此，他们仍然发现了玉米Mu因子中的Mu1、Mu4和Mu8 ，以及Mu5的部分片段， 对这些因子与其它遗传组分的相对比例进行评估，为古代玉米的种群研究提供了新的线索。

31 1993年，Goloubinoff等提取了智利和秘鲁400~4700年前考古遗址中玉米的古DNA，扩增并测序了编码乙醇脱氢酶2的核基因Adh2片段，经与美国、秘鲁、墨西哥等地现代玉米的相同基因的对比研究表明：古代玉米的序列多态性与现代玉米相同，一些古代玉米的Adh2等位基因与现代玉米相同或相似，玉米基因库已有上百万年的历史，现代家养玉米种是由几种野生玉米种演化而来的。

32 2002年，Matsuoka等的研究表明：玉米的驯化可能早在9000年前就在墨西哥南部的巴尔萨斯河流域开始了。

33 玉米表型基因研究Science 2003年Jaenicke-Després等分析了古代玉米的三个基因：控制叶腋分裂组织生长的tb1 基因、控制种子贮藏蛋白表达的pbf 基因和编码淀粉去分支酶的su1 基因。该研究所选择的材料为：来自于4300年前、2300~2800年前的墨西哥玉米样本和来自于1900年前、650~900年前的美国新墨西哥州玉米样本。

34 研究结果 现代玉米的tb1、pbf和su1等位基因在4400年前的墨西哥玉米中就已经存在，说明在玉米还没有传播到美国西南部之前，它的形态和有关蛋白质、淀粉的生物化学特征就已经开始被选择驯化了。 使玉米更容易收割的基因比增加玉米产量的基因更早地被选择保存下来；玉米棒的大小是驯化早期阶段的选择目标；而影响玉米淀粉的粘性的su1基因可能是玉米驯化后期的选择目标。

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36 玉米的传播 我们已经知道玉米起源于中美洲，此后到达南美并继续传播，但是玉米是何时到达南美，又是以什么模式进行传播的呢？

37 2003年，Freitas 等通过分析东部巴西、秘鲁和北部智利的考古学样本的Adh2 基因，发现栽培玉米扩张到南美是两次独立的事件，一条途径是从中美洲传播进入安第斯山脉地区，另一条途径是顺着大陆东北沿岸的低地传播。 2007年，Verónica等选取了南美南部安第斯考古遗址的400~1400年前的玉米样本，对其古DNA进行检测，并研究了其三个微卫星位点，结果表明：栽培玉米最初传播到南美是通过高地这个路线，而不是通过低地传播。

38 高粱古DNA研究应用 1998年，英国Durham大学的Deakin等对重要的谷类作物高粱 (Sorghum bicolor) 进行了研究，他们采集了埃及公元前800年至公元1800年间的双色高粱种子的系列样本，这些样本保存在极端的沙漠环境中，他们从这些古代高粱样本中提取了一系列不同时代的古DNA。如果将其与现代人工种植的高粱以及生长在不同地理范围内的野生高粱进行对比研究，会为揭示高粱的演化过程提供丰富的分子资料。

39 葫芦研究 葫芦 (Lagenaria siceraria) 是世界上最古老的农作物之一，在非洲、欧亚大陆及美洲的许多考古遗址中均发现葫芦的遗存。葫芦起源于非洲，在 BP到达东亚，距今8000BP在新世界广泛分布，美洲葫芦来自于非洲还是亚洲？

40 2005年，Erickson等对美洲的秘鲁、墨西哥和美国佛罗里达的一些考古遗址中的葫芦外壳碎片的古DNA进行了分析，他们利用叶绿体DNA中的三个多态性序列成功地区分出葫芦的非洲类型和亚洲类型，结果表明：葫芦最初是由亚洲而不是非洲传入美洲的。

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42 古环境复原 孢粉分析Spore-Pollen analysis

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44 冰芯 科学家们尝试从冰层最深处的冰芯中获得植物古DNA，运用这一手段可以获得这些地区古植物和古气候环境的大量信息。
2007年，Willerslev等在格陵兰岛的不同位置钻了3口井，采集从冰层表面到底部的完整的冰芯来进行古DNA分析。三口井分别为：⑴ DYE-3，位于格陵兰岛的南部地区；⑵ GRIP，位于格陵兰岛冰盖的中间部位；⑶ JEG，位于加拿大的约翰·埃文斯冰川。

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46 其中加拿大冰川的历史最短，只有几千年，因此他们用在JEG钻井中采集的样本进行了方法的测试。JEG钻井中获得的古DNA包括3种植物，且均为当地几千年来最常见的物种，由此证明从冰芯底层发现的东西可以代表当时当地的环境。 他们从超过3公里深的GRIP钻井中未获得任何DNA信息，而从2公里深的DYE-3钻井中提取出了古DNA，并获得rbcL和trnL基因间区的59~120bp序列，从而再现了这一地区近百万年间某一时候的生命景象。

47 格陵兰岛为森林所覆盖，到处分布着赤杨属 (Alnus)、云杉属 (Picea)、松属 (Pinus)、红豆杉科 (Taxaceae) 等木本植物和菊科 (Asteraceae)、豆科 (Fabaceae)、禾本科 (Poaceae) 等草本植物。这与今天加拿大东部及瑞典的北方森林生态系统相似，而与现在格陵兰岛的极地环境完全不同。 Willerslev等的研究为冰层覆盖地区远古环境、气候、生态系统的研究提供了新的方法，地球的两极有占陆地面积10%的地区存在着冰芯，因此这一研究方法有着广阔的应用前景，在更深的冰芯中或许存在着更加古老的植物的遗传信息，这将为古植物、古环境的研究带来新的革命。

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