请看书后告诉我： PCR的目的是什么？ 操作分几个步骤，分别有什么成员的参与？.

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1 请看书后告诉我： PCR的目的是什么？ 操作分几个步骤，分别有什么成员的参与？

2 故事发生在1983年 的春夏之交

3 很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一
Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物去扩增模板DNA 的想法…... Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4)

4 Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……

5 Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二
天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。

6 PCR的发展史 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；
1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1988年，第一台PCR仪问世； PCR传奇－－一个生物技术的故事。 保罗·拉比诺著，朱玉贤译。上海科技教育出版社， 1998。

7 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；
到了1991，Cetus公司以3亿美元将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。

8 PCR的应用领域

9 生物学领域几乎无处不用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析
生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）

10 医学领域 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测
DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）

11 PCR仪器的变迁 三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 ＋ 自来水冷却 （PE，1988）
三个加热块 ＋ 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）

12 从定性到定量的革命

13 琼脂糖凝胶电泳 PCR 3-4 小时 最终产物 紫外光观察

14 PCR具有极高的灵敏度 污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。
样品 正对照 负对照 标准分子量 因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。 用紫外灯破坏污染物也是一个办法

15 普通PCR和定量PCR的区别 适用定性分析，不适合定量分析； PCR 产物的长度从100bp －数kb 实时检测:每个循环都产出荧光信号
绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 bps

16 定量PCR相关的近年来 国际学术刊物上发表的论文数
2003年已经达到3000篇 1996 1997 1998 1999 2000

17 PCR会用于基因身份证的制作吗？

18 到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共有300万碱基上可能存在差异, 而真正有价值的SNP也许只有1－2万个。
防治基因信息的滥用和基因歧视，将是今后社会的重任。

19 一、PCR技术概述 1、概念 PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。 目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

20 由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。

21 PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理

22

23 PCR 动画 过 程 变 性 引 物 退 火 DNA 复制 1st cycle 2nd cycle 3rd cycle

24 PCR产物生成曲线 log[DNA] Cycles

25 目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

26 DNA在95℃下加热5min，双螺旋结构被热变性， 解链为两股单链。 ——变性
2、原理 DNA在95℃下加热5min，双螺旋结构被热变性， 解链为两股单链。 ——变性 将反应降温至55 ℃ ， DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为 ——退火 置反应混合物于70 ℃ 1分钟，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3’端开始，沿着5’—3’的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。 －－延伸 迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。

27 经上述这一循环，双链DNA拷贝数增加1倍。
进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍

28 （1）DNA模板的热变性 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。

29 影响Tm的因素： （1） DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低

30 （2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高
（3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH<4 pH>11 不利于氢键形成 （4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成

31 （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。

32 将体系温度升到700C左右，Taq聚合酶催化dNTP
（3）引物延伸 将体系温度升到700C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。 以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板）

33 3. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；
RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 逆转录

34 Taq DNA聚合酶 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’3’DNA聚合酶活性；
②无3’5’外切酶活性， 35轮0.25%错配，与原始模板有差别 可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。

35 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5—6min 变性温度：≤95℃才能使其在整个扩增循环中保持足够活性

36 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。
（3）引物 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下：

37 引物设计应符合以下基本原则： ① 长度适宜，一般为1530个碱基； ② G+C含量，一般为40％60％； ③ 4种碱基应随机性分布；
① 长度适宜，一般为1530个碱基； ② G+C含量，一般为40％60％； ③ 4种碱基应随机性分布； ④ 引物自身不应存在互补序列； ⑤ 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补； ⑥ 引物3ˊ端不应有任何修饰； ⑦ 引物5ˊ可以修饰。

38 PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；
（4）缓冲溶液与Mg2+ PCR技术常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度； （5）dNTP浓度 PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；

39 （6）参数 变性温度与时间 一般选择： 940C， 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 延伸温度与时间
一般选择： Tm - 5℃ 延伸温度与时间 一般选择： 70℃ 75℃ 循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次

40 Step 1: DNA热变性 Step 2: 引物退火 Step 3: 引物延伸 PCR法的操作过程

41 二、反应体系对PCR扩增的影响 纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性： 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度： 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性：避免反复冻融 浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少 DNA模板 引 物

42 pH值,盐离子浓度 反应Buffer Mg 2＋浓度 ddH2O 稳定剂,增强剂 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融
dNTP Mixture pH值适当 避免污染 ddH2O

43 三、PCR常见问题分析 问题一：无扩增产物 对 策 现象：正对照有条带，而样品则无； 原因
纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对 策

44 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
问题二：非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

45 对 策 问题二：非特异性扩增 原因 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度
适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 对 策

46 问题三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M

47 对 策 问题三：拖尾 原因 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 纯化模板
适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 对 策

48 对 策 问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因 靶序列或扩增产物的交叉污染
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 对 策 靶序列或扩增产物的交叉污染

49 PCR技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。

50 四、 PCR产物分析 凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。
同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。 （在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）

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53 荧光定量PCR技术 检测结核杆菌应用评价 1. 特异性 ★ 人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可扩增检测出，其它分支杆菌均否。 2. 敏感性 ★ 可检测1pg DNA，其相当于30个结核杆菌的染色体DNA量。 3. 临床应用 ★ 快速 ★ 可检测无法培养的结核杆菌

54 临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光定量PCR方法整个过程才4~5小时，远较细胞培养法为快，而且准确。
检测标本无特殊限制： 　痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检

55 荧光定量PCR检测淋球菌 淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。

56 乙型、丙型肝炎病毒的PCR检测

57 HBV感染的诊断主要采用免疫测定法检测血清标本（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，而且敏感性较低。

58 而内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法则可直接确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感，但只能检测到0.1pg的HBV DNA。
而荧光定量PCR方法则可检测到200copy/ml的HBV DNA，因而是极为有用的方法。

59 肝炎病毒的PCR检测的意义 PCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同HBV血清学标志的血清标本中的HBV DNA。
α－干扰素治疗后转阴的患者 血清中残存的HBV DNA。

60 丙型肝炎病毒的PCR检测 丙型肝炎多由输血或血液制备引起,临床预后较差,死亡率高, 所以早期诊断具有非常重要的意义.
丙型肝炎多由输血或血液制备引起,临床预后较差,死亡率高, 所以早期诊断具有非常重要的意义. 目前最为敏感和特异的方法, 属荧光基因杂交定量PCR方法。

61 肝炎病毒的PCR检测的意义 HBV及HCV的PCR检测确诊对手术相关科室待手术病人十分重要。
明确术前病人是否具有传染性，对术中医务人员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。

62 用PCR检测衣原体DNA 衣原体属包括3个种，分为： 沙眼衣原体 (引起眼部疾病和性传播疾病) 鹦鹉热衣原体 (引起呼吸道疾病)
肺炎衣原体 (引起肺炎)

63 沙眼衣原体 不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。 鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体 在人类则主要引起呼吸道疾病。
然而衣原体感染常缺乏特异症状，使临床诊断和监控甚为困难。 选择衣原体保守的16SrRNA基因为模板， 应用PCR技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。

64 应用前景 PCR技术适于： 沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断，尤其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。
根据采集标本的部位不同，检测其它衣原体的感染。 作衣原体感染的分子流行病学调查.为性传播疾病的监控提供依据。