第八章 体液蛋白质检验                                人类白蛋白分子.

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1 第八章 体液蛋白质检验                                人类白蛋白分子

2 本章内容概要： 第一节 概述 第二节 体液蛋白质测定

3 本章教学要求： 1.掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质 （前白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋
　　1.掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质 （前白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋 白的测定方法和原理。 　　2.熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤 维蛋白原的测定方法 　　3.了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液 蛋白的检测 。

4 第一节 概 述 机体蛋白质： 体液蛋白质的检测： 含量：人体固体成分的45% 机体主要的 生物大分子
第一节 概 述 含量：人体固体成分的45% 机体主要的 生物大分子 机体蛋白质： 种类：10万，3000~5000种/单细胞 功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等 体液蛋白质的检测： 疾病发生 体液蛋白质异常

5 一、血浆蛋白质的组成、功能及分类 组成： 要判断异常 种类：1000种 500种 200种 含量：μg mg g
首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点 一、血浆蛋白质的组成、功能及分类 种类：1000种 种 种 含量：μg mg g 来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂 组成：

6 功能： ①营养作用，修补组织蛋白; ②维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%~80%的血浆渗透压；
③作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质； ④作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体； ⑤体液免疫防御系统：作为免疫球蛋白与补体等免疫分子； ⑥催化作用：酶的本质； ⑦代谢调控作用；作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶； ⑧参与凝血与纤维蛋白溶解；：除Ⅳ因子外均可

7 分类： 依据来源、分离方法和生理功能 肝生成：绝大多数血浆蛋白质 来源 其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素

8 盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）
醋酸纤维素薄膜电泳：6种 分离方法 分辨率增高 琼脂糖凝胶电泳：13种 电泳法： 聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种 SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种 醋酸纤维素薄膜 - - - + 纤维蛋白原

9 即时可用的蛋白质电泳标准

10 功能分类:

11 二、个别血浆蛋白质 （一）前白蛋白（PA） 急性时相反应蛋白 结构： MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。
测定方法：免疫比浊法／免疫扩散技术。

12 功能：营养指标，载体功能（甲状腺素／维生素Ａ）。
临床意义： 敏感性高的指标； 降低：营养不良，肝功不全， 急性炎症，恶性肿瘤， 肝硬化及肾炎时。 参考值： 200～400mg/L 。

13 （二）白蛋白（ALB） 急性时相反应蛋白 结构：585个aa残基构成的单链多肽， MW=66458，含17个二硫键。
理化性质：pI=4～5.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15～19 天，占总蛋白的40%～60%，pＨ7.4时带负电。 测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG），溴甲酚紫（BCP）,盐析等。

14 功能：营养作用，载体功能（高亲和力），维持血浆渗透压和正常pＨ值。
临床意义：合成受食物影响，敏感性较低。 降低:在营养不良，肝功不全，急慢性肝疾病时; 增高:少见,假性升高。 参考值：35～50 g/Ｌ

15 （三）α1-抗胰蛋白酶（AAT） 急性时相反应蛋白
结构：394个aa残基构成的单链多肽，含10％～12%的糖MW=5.5 万。 理化性质：pI值为4.8，占α1-球蛋白区带显色的90％。 测定方法：免疫化学法，电泳（酸性凝胶电泳或等电聚焦电泳），利用蛋白酶抑制能力测定等。

16 功能：蛋白酶抑制物（具有90％的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的pＨ依赖性。
临床意义： 降低：血浆AAT仅见于胎儿呼吸迫综合症。 升高：炎症、术后，某些激素治疗后。 参考值： 0.83～1.99g/L

17 （四）α1-酸性糖蛋白（AAG） 急性时相反应蛋白
结构：181个aa残基构成的单链多肽， MW=4万，含45%的糖，其中唾液酸占11%～12%。 理化性质：pI 值2.7～3.5，肝合成，脓毒症时粒细胞和单核细胞及某些肿瘤组织也可合成。 位于α1-球蛋白区带。 测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法），ELISA法等

18 功能：与免疫防御功能有关，机制不详；抑制血小板凝集影响胶原纤维形成；参与脂类运输。
临床意义： 升高：急性炎症，组织损伤，风湿，肿瘤，AMI ，溃结时； 降低：营养不良降低, 严重肝损伤和雌激素作用。 参考值：０.25～2.0g/L 。

19 （五）甲胎蛋白(AFP) 结构：590个aa残基构成的单链多肽， MW=6.5万～７万，含4%的糖。
理化性质：pI 值４.7～４.8，在白蛋白和α1-球蛋白之间。胎儿肝／卵黄囊合成，成人量微，升高由于肿瘤细胞合成。 测定方法：免疫化学法（扩散,火箭电泳）,ELISA等

20 功能：胎儿血浆主要蛋白质，调节肝细胞生长和脑细胞发育；抑制细胞和体液的免疫反应；维持正常妊娠，防止母婴排斥。
临床意义：胎儿产前监测（羊水或母血） 增高：原发性肝癌患者诊断和鉴别（80%原发增高）， 其他癌症也可见增高。 参考值：20～100μg/L(成人) 　　< 5g/L(新生儿)

21 （六）结合珠蛋白(Hp) 急性时相反应蛋白
结构： 两对肽链形成四聚体，有变异体。 理化性质：肝合成， pI 值为4.1，电泳位a2 -球蛋白区带 测定方法：电泳法，免疫化学法（扩散,浊度）,化学法等

22 功能： 与红细胞中释出自由Hb 结合,防止Hb 从尿中丢失保存铁, 急性溶血后一周再生恢复。 高效的过氧化物酶。 需铁细菌的天然抑菌剂。 临床意义： 升高：急性时相反应； 降低：血管内溶血时；雌激素作用。 参考值：0.5～2.2 g/L

23 （七）α2-巨球蛋白(AMG) 结构： MW=62～80 万,分子量最大，由四个相同的亚基组成，含糖量约８％。
理化性质：肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期5 天。 测定方法：免疫化学等

24 功能：与多种分子和离子结合，影响蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制剂具有选择性保护某些酶的作用）。
临床意义：婴幼儿及儿童比成人高； 升高：雌激素，低蛋白血症可使其含量升高； 降低：胰腺炎及前列腺癌时。 参考值：1.31～2.93g/L

25 （八）铜蓝蛋白(CER) 急性时相反应蛋白
结构： MW=12～16 万, 1046个aa残基构成的单链多肽，含糖约10％，每分子铜蓝蛋白可结合６～８个铜原子。 理化性质：肝合成,巨噬细胞和淋巴细胞合成少量；pI 值为4.4， 具遗传基因多态性。 测定方法：免疫化学（扩散或比浊）等

26 功能：具氧化酶活性且起抗氧化剂作用，铜的无毒代谢库
临床意义： 增加—感染,创伤,肿瘤; 降低--营养不良，严重肝病及肾综;协助诊断Wilson 病 参考值：0.21～0.53g/L

27 （九）转铁蛋白(TRF) 急性时相反应蛋白
结构： MW=7.7 万,单链糖蛋白，含糖约６％。 理化性质：肝细胞合成， pI 值为5.5～5.9,半寿期7 天，可逆结合多价离子如Fe,Cu,Zn,Co 等，一分子TRF 可结合两个三价铁。 测定方法：免疫扩散法，放免法和免疫比浊法等。

28 功能：运输铁。 临床意义：血TRF 浓度受铁供应调节，缺铁TRF 升，铁治疗后恢复。可用于贫血的诊断和对治疗的监测。 降低:急性时相反应、慢性肝病、营养不良及蛋白丢失时； 升高：妊娠或雌激素会使其降低;缺铁性低色素贫血。 参考值： 2.5～4.3 g/L (成人) 　　1.30～2.75 g/L (新生儿)

29 （十）β2 －微球蛋白(BMG) 结构： MW=11800， 100个aa残基构成的单链多肽，分子中含一对二硫键，不含糖。
理化性质： pI 值为5.7，淋巴细胞合成，存在细胞表面，特别是淋巴和肿瘤细胞。释放入血循环。半衰期107 分钟，几乎由肾小管回收。 测定方法：放射免疫化学等。

30 功能：分子量小，可自由通过肾小球滤过膜，在肾小管几乎全部重吸收，可监测肾小管功能；是HLAβ链的轻链部分。
临床意义：增高：肾功能衰竭，炎症及肿瘤时。 参考值：1.0 ～ 2.5 mg/L （血浆）

31 （十一）C-反应蛋白质(CRP) 急性时相反应蛋白
结构： MW11.5～14 万，分子含５个相同的亚基，亚基间靠非共价键连接成圆盘状多聚体。 理化性质：肝合成， pI 值为6.2，电泳位于 r 区带。 测定方法：半定量沉淀法（早），免疫化学法。

32 功能：结合多糖，磷脂和核酸；激活补体，抗凝。
临床意义：第一个认定的急性时相反应蛋白,是急性时相反应的一个敏感指标，在AMI、创伤、感染、外科手术时含量迅速升高，达到正常的2000倍。 参考值：＜ 8.0mg/L （血浆）

33 三、疾病时的血浆蛋白质 （一）炎症、创伤 急性时相反应蛋白：在急性炎症或某些组织损伤时，有些血浆蛋白质含量会增高，有些会降低，这种现象称为急性时相反应。而这些血浆蛋白质被称为急性时相反应蛋白。 前述除了甲胎蛋白、β2 ～微球蛋白和 α2～巨球蛋白以外再加上纤维蛋白原的九种蛋白质

34 急性时相反应蛋白分类： 降低：前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白 升高：其他６种蛋白质。

35 急性时相反应机制： 当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞 中上述蛋白质的合成增加或减少。 急性时相反应的应用： 急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关，可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。

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37 （四）风湿病：免疫球蛋白，α1-酸性糖蛋白，结合珠蛋白及Ｃ３升高
急性肝炎 非典型的急性时相反应， （二）肝脏疾病： 慢性肝硬化 见表8-3 （三）肾脏疾病： 肾病早期 选择性蛋白质丢失 严重肾脏 非选择性蛋白质丢失 （四）风湿病：免疫球蛋白，α1-酸性糖蛋白，结合珠蛋白及Ｃ３升高 （五）遗传性缺陷：多由于编码相应蛋白质的基因发生突变或缺失。

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39 第二节 体液蛋白质测定 发展趋势: 测定体液标本: 总蛋白测定 个别蛋白质的测定 血浆：普遍 尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查
蛋白分离测定技术 测定体液标本: 血浆：普遍 尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查

40 体液蛋白质的测定方法概括： 免疫化学法特异定量个别蛋白质 常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法，
微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（ELA/ELISA）

41 电泳测定： 电泳 组成图谱 半定量 定量 定量化学测定TPr，Alb 染料结合法，UV法，折光法等

42 一、血清总蛋白测定 假设： １. 纯多肽链，含氮量平均为16 % ２.各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量

43 测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质
1.元素组成测定：含N稳定； 2.重复的肽链结构：具有多个肽键； 3.酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收； 4.与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接； 5.沉淀后借浊度测定：光度计测定； 6.光折射测定：折射仪测定。

44 方法： 1.凯氏定氮法－参考方法　　　2.双缩脲法( 推荐) 3.酚试剂法　　　　　　　　　4.散射比浊法 5.染料结合法　　　　　　　　6.UV 法 7.折光测定法

45 1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro)
原理： 消化　用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏　用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收　用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+] ） 滴定　用已标定的无机酸滴（使[H+] 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含 量成正比。

46 评价： 应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法 优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。
缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。 应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法

47 2.双缩脲法 原理： 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，
其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 双缩脲生成 加热 ＋NH3 2 H－ 1800 条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。

48 评价： 优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%＜2%，显色稳定。 缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。 应用：常规推荐方法。手工或上机使用。

49 3.酚试剂法 原理： 蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，
Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。

50 评价及应用： 优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。
缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。

51 4.比浊法 原理： 评价及应用： 某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。
优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）

52 5.染料结合法 原理： 在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。 常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等 评价及应用： 优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。 缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。

53 6.紫外分光光度法 原理： 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A A 260

54 评价及应用： 优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。
缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。 措施：在220～225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000～2000倍可消除干扰。

55 7.折光测定法 原理： 评价及应用： 溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。
优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。 缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。

56 参考范围：成人60～80g/L 临床意义： 真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等 总蛋白升高： 假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高， A/G几乎不变 总蛋白降低：①丢失过多 ②消耗增加 ③白蛋白合成减少 ④水肿

57 二、血清白蛋白测定 方法： 1.染料结合法( 推荐) 　2.盐析法 3.电泳法　　　　　　　4.免疫化学法

58 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。
1.染料结合法( 推荐) 原理: 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。 优点 缺点 BCG 易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差 在30秒内测可提高特异性 染料 BCP 与非人源性白蛋白结合力弱 与白蛋白结合特异性好

59 严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动 化分析。临床上推荐使用。
应用及评价: 严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动 化分析。临床上推荐使用。

60 2.盐析法 原理: 盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。 各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。 中性盐：硫酸铵、硫酸钠等

61 应及评价: 操作繁琐， 不宜自动化，基本不用

62 操作： 醋纤膜电泳 3.电泳法 染色 晾干 透明 染色 分离 洗脱 光密度仪扫描 比色 计算得出各种蛋白质含量 测得蛋白组分百分比 定量
半定量

63 评价及应用： 优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌． 缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料 亲和力高会导致结果偏高

64 4.免疫化学法 原理及特点: 应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.

65 参考范围:成人35～55g/L. 临床意义： 白蛋白升高： 白蛋白降低：①丢失过多 ②消耗增加 ③白蛋白合成减少 ④水肿
真性升高：未见 白蛋白升高： 假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白 白蛋白降低：①丢失过多 ②消耗增加 ③白蛋白合成减少 ④水肿 ⑤先天性ALB缺乏病

66 三、血清球蛋白测定 方法： 参考范围: 成人20～30g/L. A/G：1.5～2.5 间接法:TP-ALB=GLB
直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量) H+ 色氨酸+乙醛酸 紫色化合物 Hopkins-Cole反应: 参考范围: 成人20～30g/L. A/G：1.5～2.5

67 临床意义： 真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反 应、MM、巨球蛋白血症。 球蛋白升高： 假性升高（少见）：机体明显失水。
球蛋白降低：合成减少、低或无γ-球蛋白血症

68 四、血浆纤维蛋白原测定 血浆纤维蛋白原： 结构特点：凝血因子Ⅰ，肝合成，MW=3.4万，大分子糖蛋白，pI5.3，α2β2γ2
功能特点：参与凝血 血凝过程中的作用： 纤维蛋白原 纤维蛋白细丝 纤维蛋白网 血凝块 血液凝块构造（红色为红血球，兰色为血小板，黄色为纤维蛋白）

69 测定方法及特点： 1.纤维蛋白原凝块测定法： 应用：影响因素较多，测定结果不够准确。 2.比浊法：MW纤维蛋白原＞ MW球蛋白
分离 凝血酶或钙离子 原理：纤维蛋白原 不溶的纤维蛋白凝块 含有NaCl的双缩脲试剂反应 应用：影响因素较多，测定结果不够准确。 2.比浊法：MW纤维蛋白原＞ MW球蛋白 原理： 方法一：pH7.0时，用13.3%的硫酸胺沉淀纤维蛋白原，产生浊度 方法二：热比浊法，缓冲盐水稀释后置56℃15min，沉淀纤维蛋白原，450nm下比浊 应用：特异性不高,常使结果偏高.

70 3.盐析法：12.5%的亚硫酸钠溶液沉淀纤维蛋白原，分离洗涤
加双缩脲显色。 应用：较准确,但操作繁杂,费时,影响因素多. 4.免疫化学法：免疫电泳、扩散、ELISA 应用：特异性不高,常使结果偏高.

71 参考范围:2.0～4.0g/L 临床意义：急性时相反应蛋白，出血性疾病的诊断 升高：感染、组织损伤、休克、外科手术后、肾炎、风湿病、恶性肿瘤；放射治疗等 降低：营养不良、严重肝功损伤、ＤＩＣ、胎盘早期剥离，先天性缺乏等。

72 五、尿总蛋白测定 2/3来自血浆蛋白，主要是ALB 来源： 1/3来自肾脏与尿路的组织蛋白。
临床应用：正常儿童＜40mg／24h，成人30mg－130mg/24h ； 　　　　　　异常：蛋白尿。 检测：用于泌尿系统疾病及一些全身性疾病的筛查、疗效观察，详见肾脏功能检验。

73 六、尿微量蛋白质测定 对象：常规定量定性难以检出的一些尿蛋白。μg或mg水平
ALB、α１－m、 β2－m、ＲＢＰ、ＴＲＦ、Ｂ－ＪＰ、 α２－ＭＧ

74 七、脑脊液蛋白质测定 外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的低 分子量蛋白质,占血清蛋白质1%以下 脑脊液蛋白质来源:
内源:由中枢神经系统合成,脑脊液特有的蛋 白质

75 1.浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠 沉淀 比浊（受温度等影响）
检测方法: 正电 负电 H+ 1.浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠 沉淀 比浊（受温度等影响） 2.染料结合法： 考马斯亮蓝G-250：标本用量少、灵敏度高、显色稳定、重复 性好，但线性较差，易吸附与比色杯上干扰测定，不适合自动化 分析。 邻苯三酚红钼：具有以上优点并克服其缺点，适合上机。 3.电泳法：脑脊液浓缩后电泳。

76 参考范围：150mg~450mg/L 临床意义：多数神经系统疾病可使脑脊液总蛋白升高。