日立 L-8900 氨基酸自动分析仪.

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1 日立 L-8900 氨基酸自动分析仪

2 内容 氨基酸相关内容介绍 氨基酸分析仪发展及生产厂家 氨基酸分析仪原理及相应部件 样品的制备 应用 常见故障的分析与处理 保养

3 一 氨基酸相关内容介绍 氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。 含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物 氨基连在α-碳上的为α-氨基酸 组成蛋白质的氨基酸均为α-氨基酸

4 组成蛋白质的 20 种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即α-碳原子。
α-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和 R 基团，不同氨基酸的 R 基团不同。 每种氨基酸有 D -构型和 L -构型，天然蛋白质中的氨基酸都是 L- 构型。 广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样）

5 氨基酸在溶液中受溶液 pH 的影响存在着下列平衡
等电点（pI）：在某一 pH 的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸的等电点。

6 不同氨基酸等电点 丙氨酸 Ala （A） 精氨酸 Arg （R）10.76 天冬酰胺 Asn （N） 天冬氨酸 Asp（D） 2.98 半胱酰酸 Cys （C） 谷氨酸 Glu （E） 3.22 谷氨酰胺 Gln （O） 甘氨酸 Gly （G） 5.97 组氨酸 His （H） 亮氨酸 Leu （L） 5.98 赖氨酸 Lys （K） 蛋氨酸 Met （M）5.75 苯丙氨酸 Phe （F） 脯氨酸 Pro （P）6.30 丝氨酸 Ser（S） 苏氨酸 Thr （T）6.53 色氨酸 Trp （W） 酪氨酸 Tyr （Y）5.65 缬氨酸 Val （V） 异亮氨酸 Ile （I）6.02

7 氨基酸的化学性质 氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基（-SH）

8 茚三酮反应 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

9 氨基酸的分离分析 特殊沉淀法 离子交换法 萃取法 毛细电渗析

10 离子交换法分离分析氨基酸的原理 根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸 pK、pI 值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。

11 二 氨基酸分析仪发展及生产厂家 氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。 它与其他分析仪器区别在于只能检测氨基酸，不能作为他用，具有专一性。 1958年 stein 与moore 两人先后独立发明离子交换分离、茚三酮柱后衍生氨基酸自动分析仪。基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）， 1972年stein 与moore 两人同获诺贝尔奖。 IEC是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法 。

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13 氨基酸分析仪生产厂家及常见型号

14 日立氨基酸分析仪发展历史

15 三 氨基酸分析仪原理及相应部件 氨基酸分析仪基本分析原理：
三 氨基酸分析仪原理及相应部件 氨基酸分析仪基本分析原理： 各种蛋白质是由20种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸在低pH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（135度），生成可在分光光度计中570nm和440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质440nm检测），外标法定量。

16 氨基酸分析仪洗脱过程 1. 氨基酸在pH 2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但结合强度各不相同。
2. 随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断的被吸附、解吸附。由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小），吸附强度有差异。 3. 不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸＞芳香族氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸及羟基氨基酸。 4.提高流动相pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来，洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。 5.氨基酸标准溶液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序一定，标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。

17 通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。　

18 离子交换树脂 专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树脂的粒度一般在5-10μm之间，交联度多为8%-12%。 交联度大，树脂的网状结构紧密，孔隙度小，对外界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松，孔隙度大，适合用于蛋白质、肽类的分离。

19 L-8900氨基酸分析仪内部结构

20 日立L-8900氨基酸分析仪的组成

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26 日立L-8900氨基酸分析仪分析原理 1. 样品中的氨基酸在低pH的条件下，都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强，其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。 2.按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来。 3.分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。

27 日立L-8900氨基酸分析仪流程图

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32 分析实例：啤酒酵母

33 实例分析：猪排

34 实例分析：正常血清

35 实例分析：苯丙酮尿症血清

36 实例分析：苹果汁

37 L-8900 氨基酸分析仪性能指标 以蛋白质水解液标准分析方法为例： 净分析时间：≤30分钟 检出限：3pmol （信噪比=2，天门冬氨酸）
保留时间重现性： ≤ CV 0.3% 峰面积重现性： ≤1.0%（甘氨酸、组氨酸）

38 氨基酸分析仪特点 1. 灵敏、快速、提供数据准确可靠、分辨率高、操作简单、分析周期短（水解30分钟、体液110分钟）。
2.保留时间、峰面积、重现性好，检出限可达3pmol。 3.不存在液相方法生成二级衍生物的问题。 4.峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时即可）

39 氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型，第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法测定的经典方法（IEC）。第二类是所有基于反向色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相色谱法（HPLC）以及经阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法（IE）。

40 氨基酸分析仪法与HPLC法比较 近年来，常见的检测氨基酸的液相方法不少，现将几种常用的方法与氨基酸分析仪法进行比较：
（一）OPA法（邻苯二甲醛）（反应机理略） 不足之处：做全分析时需配以其他技术一起使用，方可带有与仲氨基团的氨基酸进行反应。赖氨酸及胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低。因为OPA是快速反应剂，有些氨基酸反应及其不稳定，有、特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很大。根据资料显示，此方法的变异系数CV%一般为5%左右，个别氨基酸如组氨酸可达9%左右，尤其对带有盐分的饲料氨基酸类样品特别不合适，因样品中带有盐分直接影响衍生（紫外发基线不好）。

41 （二）PITC法 （异硫氰酸苯脂）（反应机理略）
此方法的重现性明显低于茚三酮法，最大缺点是：一个组分衍生后可生成2个以上的衍生物。而且和其他组分峰重叠，灵敏度比较低。由于有残留的衍生剂，柱效与柱寿命降低很快（200个样品左右），变异系数在4%左右，个别氨基酸如组氨酸可达8%，某些氨基酸在24小时内即被降解。

42 （三）D-CL法 （丹酰氯） 反应比较简单，以5个 mol/L 比例，在室温、避光条件下短时间即可完成反应。 缺点：衍生物对紫外比较敏感，反应必须要在避光下进行，赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸均生成二级衍生物影响准确测量。 （四）2,4-二硝基氟苯法 此方法是比较常见的液相测定方法，最大缺点是衍生剂峰比较大，对柱子危害比较厉害。组氨酸分离不好、组氨酸的二级衍生物与丝氨酸重叠，另一个峰柱效降低时完全融入到前面苯丙峰中，直接影响定量，时间变化比较大。

43 氨基酸分析仪与HPLC常规比较

44 四 样品的制备 1. 蛋白质的水解 2. 游离氨基酸样品的制备

45 蛋白质的水解 用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都有进行水解处理，水解方法有三种：
1.酸水解法：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水解过程中采用6N 的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水解彻底，水解后的氨基酸全部以L-型形式存在，但色氨酸遭破坏。（6N HCL 、110℃真空水解24小时） 优点：HCL本身加热可以蒸发除掉。 缺点：溶液显黑褐色、与含醛基化合物作用的结果。 提示：盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭到破坏，故要求高纯度的盐酸水解样品。

46 2. 碱水解法：用2.5N NaOH （氢氧化锂）作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏（水解时20小时）
优点：水解液清亮 缺点：氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸有L-型和D-型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。 提示：只是为了测定蛋白质中色氨酸含量才会采用此水解方法。

47 3. 酶水解法：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。
优点：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破坏，产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来说，没有一种酶能全部完全水解蛋白质，与酸法比较酶法要考虑酶试剂的种类、量、温度、pH值等因素，此方法主要用于生产水解蛋白及蛋白肽。 缺点：水解时间长、而且不易水解完全。 提示：作为氨基酸全分析不可采用此法。 目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺均为酸水解法

48 4. 微波消解法：微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前处理方面显示出了良好的应用前景。
微波水解条件：体积30毫升左右高强度、耐腐蚀和透射微波的容器，水解温度 ℃，水解时间30分钟。 优点：水解时间短，适合大批量的样品前处理。（此法有待于同行的认可及实验比对数据的论证）

49 游离氨基酸样品的制备 游离氨基酸的样品在分析前必须进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18过滤柱处理。

50 生理体液样品的处理 生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为： 1. 苦味酸法 2.三氯醋酸法
3.乙醇沉淀法 4.磺基水杨酸法

51 影响氨基酸分析的各种因素 （1）样品中氨基酸浓度的影响 （2）缓冲液 pH 值、钠离子浓度的影响 （3）柱温的影响 （4）氨的影响
（5）氧存在的影响 （6）光源的影响（钨灯）

52 （1）样品中氨基酸浓度的影响 每种仪器都有其比较合适的进样量，进样浓度都有一定的范围，
本仪器要求，样品的进样量以坐标的高度100mv 为宜。 浓度太大太小都不合适，尤其是将高浓度的样品注入仪器中会造成仪器管路的堵塞，超量程工作对柱子污染、负荷也较大。最好进样分析前将样品稀释到比较合适的浓度（0.02-1mmol/L）。

53 （2）缓冲液 pH 值、钠离子浓度的影响 色谱图中各种氨基酸分离的特别好而没有峰丢失，缓冲液的 pH 值和钠离子起着重要的作用。日立氨基酸分析仪说明书中明确规定了其所有所用缓冲液的成分与配方，应严格按其要求配制，特别是 pH 值和钠离子浓度不当会出现氨基酸出峰会提前错后以及重叠现象（必要时以分离谱图为最佳原则可根据具体情况自行控制调整）

54 （3）柱温的影响 各种不同型号的氨基酸分析仪都有各自柱温的要求，在操作上一般要求柱温达到规定的温度基线稳定以后，方能进行样品的正常分析，否则会出现基线漂移影响分离效果以及准确定量。日立氨基酸分析仪柱温为57℃，如把柱温提高几度则各种氨基酸的溶出速度会加快，难分离的氨基酸会造成分离不到位现象，分离度不好。如把柱温降低几度，氨基酸溶出速度会变慢，柱压会升高，峰形不好看，会造成峰形变宽出不完全的现象，延长了分析时间。 受柱温影响比较大的氨基酸有：蛋氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸等。

55 （4）氨的影响 缓冲液、样品、流路系统混入氨时，可使基线在碱性氨基酸出峰处将基线抬高，影响碱性氨基酸分离效果和准确定量。氨的主要来源在离子水生产过程中混入的，再则试剂等级不好也有带人微量氨的可能性。在分析过程中当 pH 值低时氨被树脂所吸附，随着缓冲液 pH 值的逐步升高逐渐被洗脱下来，而在苯丙氨酸后碱性氨基酸部分把基线抬高，使赖氨酸、组氨酸、精氨酸分离定量受一定的影响。为了解决这一问题日立氨基酸分析仪采取了一项新的措施：除氨柱中装有对氨有选择性吸附的2650树脂，使氨被吸附住，防止它在分析过程中被洗脱出来，吸附在除氨柱上的氨，在分析过程中分离柱使用B5（再生液）再生时，氨被洗脱掉，2650树脂又复原，因而除氨柱可重复使用但有一定量的寿命期限。

56 （5）氧存在的影响 日立氨基酸分析仪的缓冲液、反应液、再生液等容器的液面都充满氮气使这些试剂与空气隔绝，最主要的是反应液中茚三酮最忌氧，茚三酮氧化后即变质失效，所以茚三酮购入后一定要妥善保管，特别是不能在空气中长时间暴露。缓冲液中的溶解氧也会对茚三酮显色效果造成影响。在配置茚三酮试剂时，应注意要通入足够时间的氮气以排除氧，而且试剂表面应充满氮气保护，不能让配置好的R1、R2开盖暴露在空气中，茚三酮反应液的好坏直接营养氨基酸出峰面积的大小、直接影响氨基酸分析的结果。

57 （6）光源的影响（钨灯） 由于氨基酸浓度不同与茚三酮反应液反应生成的蓝紫色物质颜色，深浅是不一样的，因而氨基酸的浓度与DYDA的吸收度成线性关系。也就是通过吸收率反应氨基酸浓度的大小，当光源不佳时，会直接影响准确分析，灵敏度也会降低，到达规定时间应当更换灯。

58 五 应用 （一）医学上的应用 （二）饲料上的应用 （三）农业、食品、饮料及其它

59 医学上的应用 利用氨基酸分析技术，苏州大学医学院在《氨基酸代谢与肝脑病》一文中，从氨基酸代谢异常角度阐述了氨基酸与肝性脑病的关系。在《脑疾病与游离氨基酸的研究》的课题中对肝性脑病与氨基酸的关系、乙型脑炎与氨基酸的关系、儿童智力不全与氨基酸的关系、脑瘫与氨基酸的关系、以及脑衰老与氨基酸的关系等方面都有相当水平的可喜成果。 山东大学生命科学院发表的《低智儿童与正常儿童中氨基酸的比较研究》一文着重阐述了血清中11种游离氨基酸的降低可直接影响人体组织的正常发育、生长，从而导致儿童智力发育不全。

60 二军大、天津总院多家医学单位利用氨基酸分析技术确定了人体血高半胱氨酸含量的升高可导致动脉硬化及血栓的形成。为医疗诊断病因提供了可靠的依据。
仅需26分钟，就可以做与动脉硬化、枫糖尿病、高蛋氨酸血症等相关的氨基酸成分和乙酰赖氨酸的分析。

61 50多种氨基酸的测量方法对生理体液中的主要氨基酸进行全面检测，为临床诊断提供了一个有效手段。

62 饲料上的应用 质量控制 真伪鉴别：如鱼粉

63 0.0125mg/20微升 鱼粉水解液实验图

64 农业、食品饮料及其它

65 发芽的大豆酿制的豆浆

66 六 常见故障的分析与处理 故障1： 泵1、泵2的显示压力都偏高。正常工作时,泵1的工作压力不超过10kgf/cm2(1kgf= N),泵2的工作压力不超过0.1kgf/cm2,而此时工作站用户界面上显示泵1、泵2的工作压力远远超过了这个限值,而且不稳定。管路的压力过高,一般为管路内被堵引起的,而泵1、泵2的压力同时过高,故障很可能发生在二者的公共管路通道上。拆开反应柱与混合器的接头,此时泵1,泵2的工作压力迅速下降为正常值(泵1为5.1kgf/cm2,泵2为0.03kgf/cm2)。说明反应柱前管路正常,故障发生在反应柱及其以后的通道上。拆开反应柱,发现其与混合器接头处的过滤网有许多污物,用蒸馏水反复清洗后,装回,工作正常。

67 故障2：仅泵1压力过高。因泵2的压力正常,可以肯定故障范围在泵1与混合器之间的管路部分。先把分离柱头分开,泵1压力仍偏高,再把保护柱断开,此时泵1压力下降为3.5kgf/cm2,说明故障发生在保护柱里,检查发现保护柱柱头的金属过滤网被脏堵,拆下用蒸馏水清洗后再装回,管路压力正常。 故障3：泵1、泵2 压力过低,而且不稳,经检查除氨氮气压力正常(为0.35kgf/cm2,整个管路没有明显漏液处,排放阀也已关紧,但在关闭排放阀时,感觉比较松动。拆下排放阀,发现排放阀的密封圈已破损。因无备件,就用薄橡胶片自制了一个O型密封圈装上后,泵1、泵2压力稳定正常。

68 故障4：样品分析结果,基线来回跳动,波峰不稳。检查泵1、泵2 工作压力和流量均正常稳定,排除了泵的脉流大而影响基线的可能性。短接分离柱后,故障依然,说明分离柱工作正常。拆下光电比色池发现被污染,先用蒸馏水清洗,然后用丙酮清洗,再用蒸馏水,清洗干净后装上,开机重试,故障排除。

69 七 保养 氨基酸分析仪属专用液相色谱仪，其常见的流路故障无非是“堵”和“漏”两个方面，而更主要的是“堵”。要想有效的预防和根除流路堵塞的故障就必须牢记“病从口入，预防为主”这八个字。下面从三个方面来阐述。

70 一、把住入口关，谨防病从口入 　　杂质进入氨基酸分析仪的渠道有三个，从进样器随样品进入，随缓冲液进入，随进样器洗涤液进入。根据这三种情况，采取相应的措施，关键是要牢牢把好“三关”。 　一是样品处理关。严格按照程序处理样品，特别对生理体液样品，更需小心谨慎，加沉淀剂一定要过量，离心所用时间宁长勿短，最后，一定要用0.22μm超滤膜进行超滤后方可上机，以防树脂的污染和柱头的堵塞。

71 二、缓冲液 这个环节往往被忽略，因为，在配制试剂时，往往都用滤纸进行过滤，过滤后的试剂虽有用肉眼不能发现的异物，但实际上，液体中仍存在着许多微小的颗粒和污染物，这些小的微粒有着很强的附着力，如不清除将造成泵过滤器、管路、柱头及比色池的污染和堵塞。柱头中的过滤器是用金属烧结而成的，它具有很小的孔径(约0.2μm)，如果溶液中有大于该直径的微粒存在，将会引起过滤的堵塞或部分堵塞，轻者导致泵压升高，重者使分析柱完全堵塞。为此，配制缓冲液的程序应当是这样的：首先，用360目的尼龙沙网过滤缓冲液(粗滤)，然后，用全玻璃的溶液过滤器装上0.45μm的微孔滤膜进行超滤。配制茚三酮的缓冲液也应按上述程序进行。

72 三、进样器洗涤液 工作时，洗涤液要每日必换。为了防止灰尘、昆虫或其它杂质等异物的落入，最好制作一个有机玻璃面罩，罩在自动进样器上面(参考尺寸为：50cm×38cm×19cm)，并在面罩前部下边20cm处留一小孔，以便引入吸样泵与吸样针之间的连线。

73 参考内容： 上海交通大学分析测试中心 侯敬丽 《氨基酸分析仪基本原理及应用》 仪表展览网 《氨基酸分析仪知识大全》 上海仪先仪器有限公司 韩春 《全自动氨基酸分析仪概况》

74 谢谢！