埃博霉素生物合成途径重构 林春燕 2012.5.20.

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1 埃博霉素生物合成途径重构 林春燕

2 肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)
模块：埃博霉素生物合成基因簇 山东大学李越中教授：黏细菌纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌株So0157-2 底盘： 肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis) 高产莫能菌素 5个乙酸单位1个丁酸单位7个丙酸单位 丙二酰辅酶A 甲基丙酰辅酶A 聚酮模 块与底 盘适配 埃博霉素生物合成模块高效表达 翻译后能充分进行修饰 足够的细胞内底物数量 底盘对产物足够高的耐受性 埃博霉素生物合成模块高效表达 翻译后能充分进行修饰 足够的细胞内底物数量

3 埃博霉素基因簇主体部分长56.020 kb，G+C含量为69.5％，不同菌株之间基因簇结构基因的序列一致性在98％左右。
147bp 15bp 115bp EpoP EpoB EpoC EpoD EpoE EpoF MT epoA/epoP, epoB/epoC 重叠→共转录 epoP/epoB(147bp) epoD/epoE(15bp) 无转录终止子 epoE/epoF(115bp) 这些基因由一个异常大的操纵子(≥56kb)构成 埃博霉素基因簇主体部分长 kb，G+C含量为69.5％，不同菌株之间基因簇结构基因的序列一致性在98％左右。 ①聚酮链的引发：在酰基转移酶的作用下，活化载体蛋白，形成活化中心; ②链合成的起始和噻唑环的形成：在EpoA和EpoP模板的共同作用下催化乙酰基和半胱氨酸，缩合形成埃博霉素合成的特殊起始物2-甲基噻唑5元杂环; ③链的延伸和转移：埃博霉素骨架每经过一个模块就有一个2碳单元结合到聚酮链上，并加以适当的修饰。在延伸阶段，埃博霉素骨架依次经过EpoC(1个PKS模块)、EpoD(4个PKS模块)、EpoE(2个PKS模块)和EpoF(1个PKS模块)，共经过了8个模块，形成了埃博霉素的16元骨架 ④链合成的终止释放和环化：在进行到EpoF末端的时候，16元环的骨架从活化位点转移到EpoF末端区域中硫酯酶的丝氨酸位点上，终止了链的合成。在环化酶的作用下，自身分子内环化，解离形成16元大环内酯类化合物; ⑤产物的后修饰：埃博霉素基因序列中的P450(EpoK)是由420个氨基酸组成，氨基酸序列与细胞色素P450氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素C-12至C-13之间的环氧化，使埃博霉素C和D环氧化成为埃博霉素A和B。

4 埃博霉素生物合成途径重构研究思路 1、考贝数 2、启动子、RBS、终止子 EPO天然启动子 红霉抗性启动子 Mon启动子 ……
方案一：两个模块，前各加一个启动子，分别游离、整合型 方案二：一个大模块，前加一个启动子，全游离或全整合型 方案三：三个模块，前各加一个启动子，两个游离型一个整合型，或两个整合型一个游离型，或全游离全整合型 2、启动子、RBS、终止子 不同强弱的启动子与大小同不模块组合 EpoA EpoP EpoB EpoC EpoE EpoF EpoD EpoA EpoP EpoB EpoE EpoF EpoC EpoD EpoA EpoP EpoB EpoC EpoE EpoF EpoD EPO天然启动子 红霉抗性启动子 Mon启动子 ……

5 原始质粒 Cos001 (KanR、AmpR) Fos001(Chl R) 两者重叠序列长度：6537bp
EpoB EpoC EpoD EpoE EpoF EpoP Cos001 (KanR、AmpR) Fos001(Chl R) 两者重叠序列长度：6537bp λRed重组系统：BW25113/pKD46(AmpR) BW25113/pIJ790(ChlR) 链霉菌结合转移：ET12567/pUZ8002(ChlR、KanR)

6 链霉菌游离、整合部件及抗性基因来源

7 一.COS002 链霉菌游离型质粒天然启动子(AprR AmpR)
SV40 neo pUC ori bla epoD part T7 T3 3.5kb pIJ101 ori acc(3) Ⅳ oriT 4.3 kb cos10Sf: CCGTAACAAGGCGGATCGCCGGAAAGGACCCGCAAATGATAATAATTATC GACGGCTTGGTGACATCG cos10Sr: CCGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACA CAATACGCAAACCGCCTC

8 420bp COS001电转入BW25113/pIJ790 以经ScaⅠ酶切的质粒pUWL201为模板PCR得4.3Kb重组片段COSyl，切胶回收 重组片段电转入BW25113/（pIJ790、 COS001） 4.3Kb 加DMSO 不加DMSO 梯度：68/52℃ 4）以验证引物C2f、C2r及C3f、C3r做PCR，并测序正确，验抗性选取Kan抗性缺失的菌，提质粒命名为COS002 5)质粒COS002电转入ET12567/pUZ8002

9 以验证引物C3f、C3r为引物，质粒为模板PCR 用EcoRⅠ酶切
646bp 6793bp 4351bp 3234bp COS001 pIJ790 COS001 COS002 1461bp

10 二.COS003 链霉菌游离型质粒红霉启动子(AprR AmpR)
Cat emEp* OE PCR Cat emEp* 1.5kb 3.3kb COS002 pUC ori bla part epoD T3 pIJ101 ori acc(3) Ⅳ oriT T7 epoA

11 1.5Kb 2kb COS002电转入BW25113/pKD46，挑单克隆验证无Chl抗性
以质粒pACYCDuet-1为模板PCR得960bp Cat片段，以质粒pIB139为模板PCR得540bp emEp*片段，切胶回收。以前两个片段为模板重叠延伸得1.5kb Cat- emEp*重组片段 重组片段Cat- emEp*电转入BW25113/（pKD46、 COS002） 以验证引物CosepF、 CosepR为引物做菌落PCR，提质粒命名为COS003 质粒COS003电转入ET12567/pUZ8002，验证无Amp抗性 1.5Kb 2kb

12 三.COS004 链霉菌整合型质粒天然启动子(KanR AmpR)
pUC ori bla part epoD T3 pIJ101 ori acc(3) Ⅳ oriT T7 epoA neo int attp 1)以链霉菌整合质粒FOS002为模板PCR得3.8Kb重组片段COSzh，切胶回收 2)重组片段Cat- emEp*电转入BW25113/（pKD46、 COS002） 3)验证引物 上游同源臂：Cos10S验2F、Fos-S验证R 下游同源臂：fos-S验证2F、Cos10S验证3r 测序正确 4)质粒COS004电转入ET12567/pUZ8002 3.8kb 1104bp 907bp

13 四.COS005 链霉菌整合型质粒红霉启动子(KanR ChlR)
bla part epoD T3 neo int oriT attp Cat emEp* 1.5kb 3.3kb pUC ori T7 epoA COS004电转入BW25113/pKD46 重组片段Cat- emEp*电转入BW25113/（pKD46、 COS003） 以验证引物CosepF、 CosepR为引物做菌落PCR，提质粒命名为COS005 3.8kb 2kb

14 五.FOS002 链霉菌整合型质粒红霉启动子原RBS(KanR)
int oriT emEp* attp Neo OE PCR cos ChlR epoC part RP FP partC …… Neo int oriT emEp* attp

15 1.6kb FOS001电转入BW25113/pKD46 以质粒pK18mobsacB为模板PCR得1.3Kb neo片段，以质粒pIB139为模板PCR得3.1kb zh片段，切胶回收。以前两个片段为模板重叠延伸得4.4kb FOSzh重组片段，切胶回收 重组片段FOSzh 电转入BW25113/（pKD46、 FOS001） 验证引物 上游同源臂：fos-S验证1F 、Fos-S验证1R 下游同源臂：fos-S验证2F、 Fos-S验证2R 测序正确 4.4Kb 1Kb 上游同源臂菌落PCR

16 六.FOS003 链霉菌整合型质粒红霉启动子红霉RBS(KanR)
1Kb int oriT emEp* attp Neo OE PCR 上游同源臂菌落PCR 质粒为模板PCR 下游同源臂 构建方法同FOS002，测序带启动子的下游同源臂，结果正确 1188bp Neo int oriT emEp* attp cos ChlR epoC part RP FP partC …… FOS001 epoD

17 七.FOS004 链霉菌游离型质粒红霉启动子原RBS(AprR ) FOS005 链霉菌游离型质粒红霉启动子红霉RBS(AprR )
cos FP partC …… FOS002/3 epoD Neo int oriT emEp* attp pIJ101 ori acc(3) Ⅳ 4.3 kb 801b FOS004 上游同源臂菌落PCR: FOS005

18 总结： 结合转移 原生质体转化 结合转移 结合转移 实验进展 实验计划 COS002 链霉菌游离型质粒天然启动子(AprR AmpR)
COS 链霉菌游离型质粒红霉启动子(KanR AmpR) COS 链霉菌整合型质粒天然启动子(KanR AmpR) COS 链霉菌整合型质粒红霉启动子(KanR ChlR) FOS 链霉菌整合型质粒红霉启动子原RBS(KanR) FOS 链霉菌整合型质粒红霉启动子红霉RBS(KanR) FOS 链霉菌游离型质粒红霉启动子原RBS(AprR ) FOS 链霉菌游离型质粒红霉启动子红霉RBS(AprR ) 实验计划 pUWL201-HygR (AprR换成HygR ) COS 链霉菌游离型质粒天然启动子(HygR AmpR) COS 链霉菌游离型质粒红霉启动子(HygR AmpR) FOS 链霉菌游离型质粒红霉启动子原RBS(HygR) FOS 链霉菌游离型质粒红霉启动子红霉RBS(HygR) 结合转移 原生质体转化 结合转移 结合转移