醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C

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1 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C
综合性设计性实验-3 蛋白质翻译后修饰位点预测 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C 目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定

2 此实验共包括如下三个部分 第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测 第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳
第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定

3 第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测 蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。 泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用； 磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程； 糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用； 脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用； 组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。

4 甘露糖化修饰预测 ：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/

5 N位糖基化修饰预测：

6 O位糖基化修饰预测：

7 豆蔻酰化位点预测：

8 乙酰化位点预测：

9 磷酸化位点预测：

10 以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果

11 第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳
电泳的含义 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。 电泳的应用 1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等 2. 分析某种物质的纯度及分子量

12 电泳的基本原理 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝QE 质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度） 当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即：QE＝6πrην E q f qE gh n π 6 = 在同一电泳条件下，不同的物质因其分子大小（r）和带电量（Q）的差异而具有不同的泳动速度，因此，电泳一定的时间（t）就可互相分离。

13 电泳的影响因素 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。

14 血清蛋白醋酸纤维膜电泳 实验目的 掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义 熟悉电泳仪器的使用和操作

15 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。 蛋白名称 等电点 分子量 白蛋白 4.88 69000 α 5.06 α1：20000 α2：30000 β 5.12 γ + 白蛋白(A) α1 α2 β γ

16 醋酸纤维素薄膜的特性 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。

17 实验操作及注意事项 膜的预处理：将薄膜切成2.5×8cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。 加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端1.5cm处用点样器蘸取新鲜血清点样（不能看见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样器。 电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，不能留有气泡，平衡5分钟，通电1h。

18 染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。
定量： 取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml； 剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时； 用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。

19 6. 计算： 光密度总和 T ＝ A+α1+α2+β+γ 白蛋白％＝A/T×100% α1球蛋白％＝ α1/T ×100% α2球蛋白％＝ α2/T ×100% β球蛋白％＝ β/T ×100% γ球蛋白％＝ γ/T ×100%

20 临床意义 正常值： 白蛋白： 57～72% α1球蛋白：2～5% α2球蛋白：4～9% β球蛋白： 6.5～12% γ球蛋白： 12～20%
正常值： 白蛋白： 57～72% α1球蛋白：2～5% α2球蛋白：4～9% β球蛋白： 6.5～12% γ球蛋白： 12～20% 急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、α2及β球蛋白减少，γ球蛋白增高。 慢性肝炎：γ球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。 肝硬化：白蛋白、α1、α2球蛋白均明显下降，γ球蛋白极度升高，甚至A/G比值倒置。 肾病综合征时，白蛋白降低，α2 、β球蛋白升高。

21 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 实验目的 学习等电聚焦电泳分离血清蛋白的原理 学习聚丙烯酰胺作为电泳介质的优点及用途
了解等电聚焦电泳和普通聚丙烯酰胺电泳的异同

22 实验原理 以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的pH梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当与自身 pI的位置中聚合成一狭窄的区带而停留下来。

23 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰（Acrylamide,Acr）和甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide,Bis）在催化剂作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶的特点：机械弹度好、弹性大、透明、化学稳定性高及无电渗等。 聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高。

24 等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。 两性电解质 － Ampholine(由瑞典LKB公司生产) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, pH范围 ，4-6.5，5-8， 。

25 在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液，其pH约为6
在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液，其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移，在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （＋） （－） 高pH 低pH

26 实验操作及注意事项 1. 凝胶配制： 取10 × 0.5cm内径的玻璃管，选择底部较齐平的一端用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），从一端量出7cm作好标记，垂直放置。 按下表配制聚丙烯酰胺凝胶，见下页 注意事项： a. 按表中的顺序加入试剂，并摇匀。 b. TEMED最后加，注意混匀。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸 铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 c. 将长滴管及时清洗

27 样品：人Hb和CytC混合物 （1mg/ml）
按下表配制聚丙烯酰胺凝胶 试剂 数量（ml） 蒸馏水 7.0 Acr Bis 2 40% Ampholine 0.2 样品：人Hb和CytC混合物 （1mg/ml） 4滴 10％过硫酸铵 0.15 TEMED 5 µl 总量 9.35 用长滴管汲取配置好的凝胶液，沿玻璃管倾斜缓慢注入到7ml标记平面，避免产生气泡。 立即用5ml注射器针头沿玻璃壁内侧面缓慢加入0.5cm高度的蒸馏水，加时贴近凝胶，尽量减少胶面与水相混和。加蒸馏水的目的除了隔离空气中的氧外，还能消除液柱表面的弯月面，使凝胶液面平坦。然后垂直静置待其聚合。

28 2. 电泳 将已聚合的凝胶去除水层，凝胶端加2％氢氧化钠消除凹面，垂直插入电泳槽中的橡皮管中； 在电泳槽中的上槽注入0.2％硫酸或5％磷酸，下槽注入0.4％乙醇胺或2％氢氧化钠。加完电极液后，要仔细检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必需排除，否则影响导电； 上槽接正极，下槽接负极，电压50V，预电泳30分钟，然后将电压维持在 V，1-2小时； 电泳结束后，取下玻璃管；

29 剥胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与玻璃管壁之间，边旋转边注水，使针头慢慢旋转前进。靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，最后可用洗耳球在玻璃管的一端轻轻加压，就可将凝胶从玻璃管内压出，凝胶盛于培养皿中。 测定样品pI 方法一：直接用PH试纸插入所需测定的蛋白区带中，此法虽然十分方便，但较为粗略。 方法二：将所需测定的蛋白区带用刀片切下，置于5ml蒸馏水的小烧杯中，经常搅拌，4小时后用PH计测其pI。

30 第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定
蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。 人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。 2D电泳可用于蛋白质转录及转录后修饰研究、蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用、细胞分化凋亡研究、致病机制及耐药机制的研究、疗效监测、新药开发、癌症研究、蛋白纯度检查、小量蛋白纯化、新替代疫苗的研制等许多方面。 蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳 (Two Dimensional Electrophoresis，2DE) 是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一 ( 另两种是质谱技术和蛋白质组信息学 ) 。 双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置。

31 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开，从而大大提高了分辨率。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度， 蛋白质组研究的重点是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。 质谱（Mass Spectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。 将双向凝胶电泳的蛋白点挖出来，用质谱分析，能得到该蛋白的分子量，质荷比等参数，随后搜索蛋白质数据库，将该蛋白判断为哪个蛋白。

32 实验设计 查阅相关资料，设计一个实验流程，分析正常人细胞与食管癌细胞间的差异基因表达，应注意什么事项；
了解目前质谱技术的种类和原理，选择哪种技术来分析这些差异表达基因； 请介绍一些双向电泳数据库的内容和使用方法。