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动物细胞与组织培养 讲课教师:刘哲 黑龙江八一农垦大学
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第一节 动物组织细胞培养基础 一、动物细胞特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度更高，结构、成分更复杂，功能更全面。
第一节 动物组织细胞培养基础 一、动物细胞特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度更高，结构、成分更复杂，功能更全面。 动物细胞的连接： 封闭连接：紧密连接、间壁连接 锚定连接：粘合带与粘合斑，桥粒与半桥粒 通讯连接：间隙连接，胞间连丝，化学突触
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3 .动物细胞的特点及生长特性 动物细胞大，无细胞壁 动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染 需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感
3 .动物细胞的特点及生长特性 动物细胞大，无细胞壁 动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染 需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感 动物细胞间主要以聚集体形式存在 原代细胞一般繁殖50代即退化死亡 动物细胞虽可像微生物细胞一样, 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比, 有显著差别 :①动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差; ②倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; ③培养过程需氧量少(氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长) ; ④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; ⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代谢产物具有生物活性, 生产成.本高, 但附加值也高。 动物细胞虽可像微生物细胞一样, 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比, 有显著差别 :①动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差; ②倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; ③培养过程需氧量少(氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长) ; ④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; ⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代谢产物具有生物活性, 生产成.本高, 但附加值也高。
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一些不同形状的人体细胞
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Hepatocytes(肝) 胰岛 肝细胞
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血液凝块
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免疫细胞 Ｔ细胞与Ｂ细胞 巨噬细胞 白血球 Ｔ细胞与Ｂ细胞 巨噬细胞 纤灭癌细胞
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树突细胞:
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嗜中性粒细胞吞噬志贺杆菌
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巨核细胞
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骨细胞
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成骨细胞
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破骨细胞(紫色)
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胶质细胞
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正常衰老细胞
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正常衰老细胞（红色）和死亡细胞
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细胞凋亡的核变
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癌症细胞
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大片自由基和被其污染至病的细胞 细胞变异，增大的癌症细胞
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乳腺癌细胞
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脑部细胞癌变
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由于营养过剩导致的细胞和由此导致死亡
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病死的肌细胞
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SEM of retina of eye showing rod cells (photoreceptors）
扫描电镜的眼睛显示视网膜视杆细胞
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Scanning electron micrograph of a human sperm contacting a hamster egg.
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人上皮细胞培养7 d 尿路上皮细胞
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小鼠胚胎成纤维细胞
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体外培养的间充质干细胞
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黑色素细胞
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第二节动物细胞与组织培养 基本概念 一 分类:
一 分类: 动物细胞与组织培养： (Cell and Tissue Culture) 指的是从动物组织或细胞从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。 器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
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Classification of Cell Cultures
Primary Culture Cells taken directly from a tissue to a dish 原代培养：直接取自动植体的组织或细胞的培养。 Secondary Culture Cells taken from a primary culture and passed or divided in vitro. 传代培养：从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。 These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergo apoptosis. Apoptosis is programmed cell death
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Contact inhibition When cells contact each other, they cease their growth. Cells arrest in G0 phase of the cell cycle Transformed cells will continue to proliferate and pile upon each other cease [简明英汉词典] [si:s] v.停止, 终了
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Primary Culture outgrowth and migration of cells
细胞的生长和迁移 朔型 outgrowth and migration of cells retention of the 3D shape
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细胞系(cell line)：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。
细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。
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二 发展历史 动物细胞组织培养的奠基人是美国生物学家哈里森，1907年盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。
二 发展历史 动物细胞组织培养的奠基人是美国生物学家哈里森，1907年盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。 1923年，法国学者卡勒尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。 卡瑞尔把无菌技术带到组织培养中。
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a.生物制品的生产 b.转基因动物的培养 c.检测有毒物质 d.医学研究
三 动物细胞培养的应用 a.生物制品的生产 b.转基因动物的培养 c.检测有毒物质 d.医学研究 在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。 外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制的传代和生长。
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四 培养细胞按生长方式分: （一 ）贴附型细胞 （1）成纤维细胞型细胞： （2）上皮型细胞: （3）游走型细胞 （4）多形型细胞
四 培养细胞按生长方式分: （一 ）贴附型细胞 （1）成纤维细胞型细胞： （2）上皮型细胞: （3）游走型细胞 （4）多形型细胞 （二）非贴附型细胞 (悬浮型) 但有些细胞既可贴附生长，也可悬浮生长。 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类
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（一 ）贴附型细胞 贴附生长是大多数细胞在体内生长的基本存在方式。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。
（一 ）贴附型细胞 贴附生长是大多数细胞在体内生长的基本存在方式。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。 如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。
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（1）成纤维细胞型细胞： 长梭形或不规则，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。
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成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名
成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名. 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。
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成纤维细胞
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（2）上皮型细胞: 此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，
细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时彼此紧密连接成单层细胞。 生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。
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上皮型细胞
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主动脉血管内皮细胞（ 100 倍）
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（3）游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。
此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。 常见于羊水细胞培养的早期。
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体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。
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单 核 巨 噬 细 胞 1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落； 2、细胞胞质常伸出伪足和突起。 3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。 4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。
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（4）多形型细胞 形态上不规则的细胞，一般分胞体和胞突两部分,如神经组织细胞.
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（二）非附型细胞 悬浮生长细胞：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。
这类细胞特点：胞体始终是球形、密度较高，培养效率高、易大规模生产。 体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。
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五.影响细胞形态学特征的因素 血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。
如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞,但在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。
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第三节动物组织细胞培养要求 一 体外培养特点:
一 体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。
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二培养工具: 培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。 细胞培养以玻璃器皿为主。 器皿应选择透明度好、无毒、 中性硬度玻璃制品。
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根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。
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三、培养条件 细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
【讨论】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。
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1）恒定的温度:37 ℃， 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低 温度：温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。
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2）PH：7.2-7.４ 当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 用来检测PH的变化：红色--pH7.4，
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3) 气体： ＣＯ２有调节PH的作用。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为 ，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。
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4）营养—培养基： 在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。 动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。
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合成培养基 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、 RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。
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天然培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。
血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。
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常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。
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氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。 水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。
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无血清培养基 动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。
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5) 细胞培养溶液 平衡盐水（BSS）： Hanks 液和Earle液是常用的BSS基础溶液。 PH调整液：
NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸） 细胞消化液: 胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．胶原酶溶液
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抗生素溶液： 1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素. 2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。 3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。
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6)、无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 清洁，无污染 单细胞比群落细胞更难培养 合适的培养基和溶液
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四细胞培养设施 1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
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细胞培养实验室 准备室 3.培养室 1.准备室 2.缓冲室 保证无微生物污染 风淋
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培养室 专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。
内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。 缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等
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风淋室： 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35℃较为适宜。
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超净工作台 也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
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CO2培养箱 哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。
哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。 CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。
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冰箱 细胞培养的冰箱应特别注意清洁， 防止污染。
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水纯化装置 细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。
水纯化装置 细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。 玻璃器皿也要用重蒸水反复冲洗。
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过滤装置 各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。
过滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌
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细胞冷冻贮存器 细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。
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培养器皿 培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。
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洗刷消毒间： 烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 分析间： 显微镜、计算机及打印机等。
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无菌操作的要领 由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。 超净工作台消毒 打开紫外线杀菌灯照射消毒20～30分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。 洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。 根据实验要求准备好已消毒的所需用品，清点无误后放在超净工作台内。
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火焰消毒 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。
所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。 注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。 无菌环境中操作时,首先要点燃酒精灯。所有操作均应在近火焰处进行， 操作 动作应准确敏捷，不应太快，以防空气流动增加污染机会。不能用手触机及器皿的消毒部分。
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合理布局 右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。
酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立,易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。
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五)、培养细胞形态分析 培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脂滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
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动物细胞培养中血清的作用： （1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。 （2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。 （3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。 （4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。
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（5）提供PH\缓冲物质，调节培养基PH。 （6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。
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血清可能引发的问题 （1）所有的血清都是一种成分不确定的混合物，批与批血清之间的组分存在差异； （2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。 (血清来源于动物，有可能携带传染源，包括病毒和有毒物质，对正在生长的细胞系或者制品带来风险)
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（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。 (4)培养液营养的不足，细胞密度低、活力低，影响了细胞表达，导致疫苗等生物制品的生产效率和产量低。
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cell lin
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细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。
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The End
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