microRNA与炎症和氧化应激： 抗动脉粥样硬化的理论与策略

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1 microRNA与炎症和氧化应激： 抗动脉粥样硬化的理论与策略
天津医科大学第二医院 天津心脏病学研究所 李广平

2 任何原因引起的动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。
动脉硬化概念 任何原因引起的动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。 内皮细胞 内膜 (止血、血栓形成、血管张力、 通透性，动脉粥样硬化形成部位） 内皮下层 内弹力板 中膜（平滑肌构成,血管张力） 1.在讲解动脉粥样硬化之前，先要介绍一下正常动脉的结构。正常动脉分为内膜、中膜、外膜三层结构。其中内膜靠近血管管腔的部分由内皮细胞构成。 2.临床上经常容易把动脉硬化和动脉粥样硬化概念混淆。事实上动脉硬化是比动脉粥样硬化更大的概念。它是指任何原因引起的动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。 外膜（动脉供血和神经分布） 上皮细胞 动脉结构 2

3 主要累及大型弹力型动脉（如主动脉）和中型弹力型动脉（冠状动脉和脑动脉最多）
动脉粥样硬化的全身疾病表现 脑动脉粥样硬化 颈动脉粥样硬化 急性脑血管病 急性脑血管病 血管性痴呆 主动脉粥样硬化 冠状动脉粥样硬化 冠状动脉粥样硬化是动脉 粥样硬化的最常见类型， 是造成我国成年人死亡的 头号杀手！ 心绞痛 心肌梗死 缺血性心肌病 主动脉瘤 夹层动脉瘤 内脏动脉粥样硬化 关键信息： 动脉粥样硬化可发生在全身各个主要血管，并造成相应的器官损害。 一项队列研究表明：血管疾病和癌症是中国成年人死亡的主要原因，其中冠心病是我国40-64岁成年人的头号死亡原因。 顽固性高血压 肠系膜动脉血栓 下肢动脉粥样硬化 间歇性跛行 坏疽 主要累及大型弹力型动脉（如主动脉）和中型弹力型动脉（冠状动脉和脑动脉最多） 顾东风, Jiang He, 吴锡桂, 等. 中国成人主要死亡原因及其危险因素. 中国慢性病预防与控制 2006; 14(3): 3

4 Atherosclerosis(AS) and Vulverable plaque (VP)
动脉粥样硬化 (AS) 是一个全身性的炎症反应，某些可溶性的炎性介质与VP局部的不稳定状态有关，包括C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)、趋化因子 (chemokines, CCL2 and CCL5)、基质金属蛋白酶 (MMPs, MMP-2, MMP-9)。 目前研究发现，AS斑块内巨噬细胞分泌的MMPs与AS斑块的稳定性密切相关。 MMPs及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)是一个迄今至少有20种锌和钙依赖性的内肽酶组成的家族，在单核巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞中广泛表达。

5 Atherosclerosis(AS) and Vulverable plaque (VP)
AS斑块内的MMPs主要来源于巨噬细胞及平滑肌细胞。 在AS斑块中，MMP-9的表达增加，并且MMP-9高表达与斑块破裂有关，其机制在于MMP-9具有降解细胞外基质 (ECM) 的作用，通过降解AS纤维帽促进斑块破裂，从而参与AS斑块去稳定的作用。 胞浆中的RAS激活后磷酸化RAF1，磷酸化的RAF1再激活MEK1/2，活化的MEK1/2（主要是MEK1）再磷酸化ERK1/2（ERK2起主要作用），活化的ERK1/2转入细胞核内可调控基因的转录。体外实验证实ERK1/2的活化可以促进AS斑块内的血管平滑肌细胞、中性粒细胞分泌MMP-9，从而增加斑块的易损性。因此，MEK/ERK通路可以通过调节MMP-9的表达促进AS及增加斑块的易损性。

6 Atherosclerosis(AS) and Vulverable plaque (VP)
丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 是哺乳动物重要的细胞内酶，可以通过磷酸化下游的蛋白从而将细胞外的信号经由细胞浆向核内传递，参与细胞的增殖、分化、转化及凋亡。 MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。

7 Atherosclerosis(AS) and Vulverable plaque (VP)
其中，MEK/ERK通路 (ERK即细胞外调节蛋白激酶，MEK即MAPK/ERK激酶，是其上游激酶) 是最经典的MAPKs通路。 MEK/ERK通路是相对保守的信号通路，在细胞外各种信号（包括生长因子、细胞因子）刺激下胞浆中的RAS激活后磷酸化RAF1，磷酸化的RAF1再激活MEK1/2，活化的MEK1/2（主要是MEK1）再磷酸化ERK1/2（ERK2起主要作用），活化的ERK1/2转入细胞核内调控基因的转录。 体外实验证实ERK1/2的活化可以促进AS斑块内的血管平滑肌细胞、中性粒细胞分泌MMP-9，从而增加斑块的易损性。 因此，MEK/ERK通路可以通过调节MMP-9的表达促进AS及增加斑块的易损性。

8 动脉粥样硬化的形成 LDL是致动脉粥样硬化的基本因素 内皮损伤是关键因素 炎症反应贯穿始终 内皮功能 受损 LDL进入内 皮下被氧化
关键信息：下面回顾一下动脉粥样硬化的形成过程。 1.各种危险因素的影响下，内皮损伤，功能紊乱。内皮的渗透屏障作用被破坏。 2.LDL通过血管内皮进入血管壁内，在内皮下滞留的LDL被修饰成氧化型LDL（Ox-LDL），巨噬细胞吞噬Ox-LDL后形成泡沫细胞，后者不断地增多、融合，构成了动脉粥样硬化斑块的脂质核心。 3.大量研究提示，在动脉粥样硬化形成过程中，持续发生一系列的慢性炎症反应。所以，有研究认为，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，。 总结一下：内皮损伤是动脉粥样硬化形成的关键因素， LDL是致动脉粥样硬化的基本因素，而炎症反应贯穿始终 内皮功能 受损 巨噬细胞 吞噬ox－LDL 形成泡沫细胞 LDL进入内 皮下被氧化 平滑肌细胞 增殖和迁移 形成纤维帽 斑块破裂局部 血小板聚集 血栓形成 炎症反应增加 8

9 炎症反应贯穿始终－ 动脉粥样硬化起始阶段炎症促进斑块的形成
血管内腔 单核细胞 LDL Endothelium 粘附分子 (VCAM-1, ICAM-1) LDL 炎症介质 (CRP, CD40/CD40L, TNF-α, IL-1, IL-6) 关键信息：这是在动脉粥样硬化起始阶段，炎症促进粥样硬化斑块形成的示意图。 LDL-C进入动脉壁，沉积于动脉内膜，并被氧化，氧化的LDL-C容易被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞，同时引发炎症反应。巨噬细胞可分泌包括CD40/CD40L, TNF-α, IL-1, IL-6 ，CRP等在内的多种炎症成分，CRP只是其中一种。在这些炎症物质的作用下，内皮功能降低。 The major risk factors that promote atherogenesis — cigarette smoking, hypertension, atherogenic lipoproteins, and hyperglycemia — are well established and are known to give rise to a variety of injurious stimuli that activate the inflammatory process. The majority of acute coronary events arise from plaque rupture and thrombosis. The fibrous cap is not a static structure and is constantly being remodeled. Smooth muscle cells and collagenous fibrils are important structural components of the cap. CRP is one of a number of markers (others include CD40/CD40L, TNF-α, IL-1, IL-6 ) which increase dramatically during the inflammatory mechanisms that promote atherosclerosis process through the inhibition of collagen synthesis and the stimulation of collagenase secretion. Such processes result in making the fibrous cap vulnerable and susceptible to rupture. These events are thought to contribute not only to the formation of plaque but may also contribute to its disruption resulting in the formation of a blood clot. Thus, virtually every step in atherogenesis is believed to involve substances involved in the inflammatory response and cells that are characteristic of inflammation. Ox-LDL 内膜 泡沫细胞 巨噬细胞 CD40L=CD40 配体； TNF-α=肿瘤坏死因子-alpha; IL=白介素; VCAM=血管细胞粘附分子; ICAM=细胞间粘附分子. Cockerill GW et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995;15: ; Andre P et al. Circulation. 2002;106:896-9; Libby P. Circulation. 2001;104:365-72; Libby P et al. Circulation. 2002;105: ; Ross R. N Engl J Med. 1999;340: 9

10 积极降低LDL-C可逆转动脉粥样硬化斑块
动脉粥样病变体积百分比* 的变化（％） 病变进展 -1.0 -0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 60 70 80 90 100 110 120 ASTEROID3 瑞舒伐他汀 A-Plus2 安慰剂 ACTIVATE1 CAMELOT4 REVERSAL5 普伐他汀 阿托伐他汀 平均LDL-C(mg/dL) 病变消退 50 瑞舒伐他汀40mg未在中国注册 瑞舒伐他汀尚未在中国注册逆转动脉粥样硬化斑块的适应症 †ASTEROID和REVERSAL研究了他汀类药物治疗的有效性；A-PLUS、ACTIVATE和CAMELOT研究了非他汀类药物的疗效，但这些研究中含安慰剂对照组，包括既往应用他汀类药物治疗的患者（分别为62%、80%和84%） *ASTEROID和 REVERSAL中用PAV变化的均值表示。A-PLUS、ACTIVATE和CAMELOT研究用PAV变化的均值表示。 1 Nissen SE, et al. N Engl J Med. 2006;354(12): Tardif JC, et al. Circulation. 2004;110(21): 3 Nissen SE, et al. JAMA 2006;295(13): Nissen SE, et al. JAMA ;292(18): 5 Nissen SE, et al. JAMA. 2004;291(9):

11 普罗布考抗氧化作用 管腔 LDL LDL 内膜 氧化修饰 LDL MMPs 单核细胞 粘附 内皮细胞 巨噬细胞 泡沫细胞 Probucol
VCAM-1 LDL 穿越 粘附 内皮细胞 LDL 内膜 氧化修饰 LDL SR-A MMPs 巨噬细胞 泡沫细胞 23 Probucol

12 miRNA概述 MicroRNA(miRNA)是一组内源性非编码单链微小RNA，通常由约22个核苷酸组成，自2000年在人体中发现第一个miRNA lethal-7（let-7）以来，至2013年4月，miR Base数据库已经记录了193个物种共25141个成熟的miRNA ，其中包括在人类细胞已经克隆的2042个成熟miRNA 美国《Science》杂志于2002年12月19日评出2002年世界十大科技突破的第一条即是miRNA 最近的研究表明，miRNA与肿瘤、心血管疾病、阿尔兹海默病等密切相关

13 miRNA概述 第1篇与心脏功能相关的miRNA研究出现于2005年。现今发现miRNAs几乎能够调控所有心脏病理生理过程[22]
和动脉粥样硬化相关的miRNA包括miRNA-21、miRNA-221/222、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-125-5p、let-7等，通过和相应的靶基因结合，在促进血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移、抗炎、再内皮化等AS的过程中发挥重要的作用

14 miRNAs的产生及成熟过程

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16 miRNAs 在斑块发生、发展及破裂中的作用

17 参与AS斑块形成、发展及破裂的miRNAs及其可能作用

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26 miR与动脉粥样硬化 随着研究的深入，近年有研究人员发现miRNAs还可以促进下游靶基因的表达，某些时候，miRNAs还可通过与基因启动子非编码区结合，正性调控（促进转录和翻译）靶基因。 但负性调节是最常见的调控方式，它们通过抑制特定蛋白的表达来执行调控功能，一个miRNA可调控若干个蛋白，同时一个蛋白又受到多个miRNA的调控。 由于miRNAs重要的调控作用，miRNAs成为目前心血管领域研究的重点和热点之一，许多研究结果提示miRNAs在心血管疾病发病过程中扮演着重要角色。

27 miR与动脉硬化 研究表明，血管细胞黏附分子1 (VCAM-1) 是miR-126的靶基因，敲除miR-126可导致TNF-α诱导的VCAM-1表达上调，从而促进白细胞向内皮细胞的黏附，miR-126可能通过抑制VCAM-1的表达在AS的发展过程中起保护作用。 与正常血管壁相比，泡沫样损害的血管壁miR-21呈高表达，而敲除miR-21可减轻血管内膜损害，减少内膜增生[35]，提示抑制miR-21的功能可能具有抗AS作用。

28 miR与动脉粥样硬化 同样有研究发现，在大鼠缺血预适应后，21种miRNAs表达上调，19种miRNAs表达下调，其中miR-21上调表达最明显，对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡有一定的保护作用。 另外，有研究发现miR-320可通过负性调节应激蛋白热休克蛋白 (heat shock proteins, HSP) 20的表达参与缺血-再灌注损伤过程，向离体再灌注的小鼠心脏注射miR-320能明显减小心肌梗死面积。

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33 MicroRNA lethal-7b 氧化应激在AS的发生发展中发挥了重要的作用。近年来，广泛应用于临床的瑞舒伐他汀和普罗布考除了降血脂外的多效性日益得到大家的热切关注，而两者联用抗AS氧化应激的作用及机制尚未见报道 microRNA（miRNA）是一类内源性非编码的单链微小RNA，广泛参与了AS的过程，其中，miRNA lethal-7b（let-7b）是最早发现的miRNA之一，其在内皮细胞中高表达,而其在AS氧化应激中的作用尚未见报道

34 HO-1: 血红素氧化酶 HO-1的抗氧化作用途径：HO-1可以通过抑制炎症因子IL-1、TNF-α的表达、抑制血小板聚集和活化、抑制内皮细胞凋亡等发挥抗氧化作用，进而抑制动脉粥样硬化的进展

35 Nrf2和Nrf2/ARE通路 核因子E2相关因子2（Nrf2），又称ECH,是具有基本亮氨酸拉链（bZIP）结构的一种核转录因子
Nrf2与CNC家族中含有bZip结构的其他成员相似，通过与小Maf蛋白、cjun、ATF4等形成异源二聚体，结合到抗氧化应激元件（antioxidant-response element，ARE）上，调节200多种基因包括抗氧化基因、II相解毒酶基因、转运蛋白等的表达 Nrf2/ARE通路通过诱导抗氧化酶的表达发挥着抗AS、抗炎等重要作用

36 Bach1/Nrf2-HO-1通路 转录因子BTB-CNC同源异构体1（BTB (broad-complex tramtrack and bric-a-brac)和 CNC homology proteins，Bach1和Nrf2同属于CNC转录因子家族 用siRNA技术沉默Bach1的表达，可以诱导HO-1表达，表明Bach1可以特异性的抑制HO-1表达，从而促进AS的进展 我们的研究中，H2O2通过抑制let-7b提高Bach1蛋白水平，进而抑制Nrf2和HO-1的表达，进而发挥对细胞的氧化应激损伤。过表达Let-7b可以对抗此作用，抑制Bach1的表达，进而升高Nrf2和HO-1水平，进而发挥对细胞对抗氧化应激的保护作用 这是在国内外首次阐明let-7b在HUVEC氧化应激中的作用

37 Bach1/Nrf2-HO-1通路示意图

38 let-7b和BACH1/Nrf2-HO-1通路
转染let-7b mimics 20nM至HUVEC，可以抑制Bach1蛋白表达，进而升高Nrf2和HO-1蛋白表达；转染let-7b inhibitor 20nM至HUVEC 可以使Bach1蛋白表达上升，进而使Nrf2和HO-1 mRNA水平明显下降，Nrf2和HO-1蛋白表达下降，提示let-7b可以保护细胞对抗氧化应激 抑制let-7b可以减弱瑞舒伐他汀对细胞对抗氧化应激的保护作用。瑞舒伐他汀可以升高冠心病患者血中let-7i水平，抑制TLR4水平，从而发挥抗AS作用 抑制let-7b可以通过Bach1/ Nrf2-HO-1通路减弱普罗布考对细胞抗氧化应激的保护作用，普罗布考也有可能是通过促进let-7b的表达进而影响Bach1/Nrf2-HO-1的通路发挥抗氧化作用的

39 MiR-146a与AS免疫炎症 MicroRNA-146（miR-146）是第一个被发现在免疫系统中具有调节作用的microRNA（miRNA)，包括miR-146a和miR-146b两种形式 近年研究表明，miR-146a在AS斑块中高度表达，表明miR-146a和AS密切相关 冠心病患者外周血单核细胞miR-146a/b，TLR4的下游分子IRAK1和TRAF6的mRNA及TLR4 mRNA/蛋白均升高，miR-146a/b和高TLR4 mRNA及TLR4蛋白是心脏事件的独立的预测指标

40 MiR-146a与AS免疫炎症 应用普罗布考干预后，miR-146a、TRAF6蛋白、NF-κB mRNA表达下降，TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA无明显变化 普罗布考联合瑞舒伐他汀对miR-146a及TLR4/NF-κB信号通路具有拮抗作用 普罗布考联合瑞舒伐他汀通过抑制miR-146a、TLR4及下游MyD88依赖性途径MyD88、TRAF-6发挥其抗炎作用，这可能是其抗AS的机制之一 普罗布考联合瑞舒伐他汀能够抑制LPS诱导人THP-1单核细胞miR-146a及TLR4 /NF-κB 信号的转导，从而减轻炎症因子IL-6和TNF-a的释放起到抗AS的作用 ApoE-/-小鼠经普罗布考/瑞舒伐他汀治疗12周后，TC、LDL水平显著下降，普罗布考联合瑞舒伐他汀通过降低miR-146a、阻滞TLR4/NF-κB信号起到抗AS的免疫炎症作用

41 miR-497与AS 我们在构建MMP-9高表达的HUVECs细胞模型的基础上，将hsa-miR-497 mimics/inhibitor瞬时转染HUVECs，使hsa-miR-497在HUVECs内过表达及抑制表达，转染后24小时收集细胞RNA，应用real-time RT-PCR的方法测定hsa-miR-497的表达 结果表明我们构建的MMP-9高表达细胞模型中，hsa-miR-497表达下调，而MEK1 mRNA、MMP-9 mRNA的表达上调 为验证hsa-miR-497是否抑制靶基因的翻译过程，我们应用western-blotting的方法测定hsa-miR-497过表达及抑制表达后MEK1、MEK/ERK通路蛋白及MMP-9的蛋白表达情况 抑制hsa-miR-497表达后MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-9表达均增加 (P＜0.01)。这些结果都支持hsa-miR-497可能通过抑制MEK1的翻译及蛋白表达过程而起到负性调控靶基因的作用

42 miR-497与AS 普罗布考/瑞舒伐他汀可以抑制MEK1 mRNA、MMP-9 mRNA的表达水平
普罗布考/瑞舒伐他汀可能通过增加hsa-miR-497的表达从而抑制靶基因的蛋白表达 高脂喂养apoE-/-小鼠的同时给予普罗布考/瑞舒伐他汀，结果用药后mmu- miR-497表达增加，表明普罗布考/瑞舒伐他汀可以升高mmu-miR-497的表达 普罗布考/瑞舒伐他汀可能通过升高miR-497而发挥稳定斑块的作用

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48 Statins, Ezetimibe, Probucol,....,PCSK9,...

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50 PCSK9 and miR Sehgal A, Vaishnaw A, Fitzgerald K. Liver as a target for oligonucleotide therapeutics. J Hepatol Jun 12. pii: S (13) doi: /j.jhep [Epub ahead of print] SourceAlnylam Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA 02142, USA. Electronic address: KEYWORDS: 2′-O-methoxyethyl, ALAS1, ANGPTL3, Antisense, FVII, FXI, GCGR, HCC, HCV, HoFH, KSP, LDL, LNA, Liver disease, MOE, MTP, Oligonucleotides, PCSK9, PLK1, Polo like kinase 1, RISC, RNA induced silencing complex, SAA, TMPRSS6, TTR, UTR, VEGF, angiopoietin-like 3, factor VII, factor XI, glucagon receptor, hepatitis C virus, hepatocellular carcinoma, homozygous familial hypercholesterolemia, kinesin spindle protein, locked nucleic acid, low density lipoprotein, miR, miRNA, microRNA, microsomal triglyceride transfer protein, proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, serum amyloid A, short interfering RNA, siRNA, transmembrane protease serine 6, transthyretin, untranslated region, vascular endothelial growth factor, δ-aminolevulinate synthase 1

51 PCSK9 and miR

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54 小 结 正确的调脂治疗是防治动脉硬化的关键 重视炎症、氧化应激、内皮功能损伤对AS的影响
小 结 正确的调脂治疗是防治动脉硬化的关键 重视炎症、氧化应激、内皮功能损伤对AS的影响 他汀、抗氧化剂、CCB、ACEI和ARB可能均具有抗动脉硬化的作用 microRNAs的上调（个别的下调）可以达到抗AS和稳定斑块的作用 他汀和抗氧化剂可能通过microRNAs及其炎症信号通路发挥调控血脂代谢和抗AS的作用

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