核酸分子杂交.

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1 核酸分子杂交

2 一、概念： 1、分子杂交（hybridization) :有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。 2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体支持物上的过程。 3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。

3 4、种类： 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 液相杂交（solution hbridization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。 DNA与DNA杂交 DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交

4 5、几种常见的杂交： 分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： 　　(1) Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。 　　(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。

5 二、Southern杂交 1、步骤： Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤: 　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 　　(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 　　(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 　　(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。 　　(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。

6 Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。

7 2、固体支持物的种类： 带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜 尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。 尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

8 尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。 就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。 就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

9 3、转膜的方式： 将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种: (1)毛细管转移。本方法由Southern发明，故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。 (2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。

10 (3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。

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14 4、毛细管转移法转膜用的溶液： （1）高盐溶液：1.5M NaCl （2）0.4N NaOH 如果DNA分子大，可以用0.25N HCL处理或用紫外线处理，将DNA分子适当打断，以提高转移的效果，注意处理的时间适度！！

15 5、转膜后DNA的固定方式： 转膜后，膜用2×SSC漂洗，然后固定： （1）80℃干烤0.5-2小时； （2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。 后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。

16 三、Northern杂交 Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。 注意： （1）RNA对碱性敏感，不能用NaOH溶液作为转膜夜。如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L NaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。

17 （2）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。

18 四、菌落原位杂交 　　对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（ ）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。

19 五、斑点杂交 　　 斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。

20 六、影响杂交的因素 1、温度 杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。

21 通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见下表。最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃ 　　苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃) 　　非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃) 　　在2×SSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃。

22 DNA—DNA杂交温度的选择范围（2×SSC）
G+C % 杂交反应温度（℃） Tor Ts Tns 30 62.3 73.3 52.3 35 64.9 74.9 54.9 40 67.4 77.4 57.4 45 70.0 80.0 60.0 50 72.5 82.5 62.5 55 75.1 85.1 65.1

23 如果综合考虑： Effective Tm＝ (logM[Na+])+0.41(%G+C) – 0.72(%formamide) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在65℃杂交，而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。 2、  离子强度 离子强度增加，Tm值增加，一般用 mol/L 的NaCl 3、 DNA的浓度 最低检测水平为单拷贝为：0.5pg

24 4、探针的浓度： 总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml 探针质量衡量的指标：比活性即 cpm/μg 如果比活性为108cpm/μg ，用的浓度为10μg/ml， 比活性为109cpm/μg ，用的浓度为2μg/ml。

25 5、探针的长度和同源性 ： 为了保证杂交的特意性，一般需要用500pb左右的长度的探针。但是，探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。在浓度一定时，杂交率主要影响因素是探针的长度，长的探针杂交时间很长，而短探针容易退火，因此标记好的探针长度为100 nt左右，太短将探针与目的序列的结合。

26 探针与被检测的DNA之间的同源性也影响Tm：
1% mismatch of two DNA lowers the Tm 1.4℃ 如果杂交温度为67.5℃，要求DNA间的同源性为87.5%，在65℃、5xSSC的条件下，要求探针与被检测的DNA之间的同源性为多少？ 假设：％（G＋C）＝45％ Tm＝ (log0.825)+0.41(45%)=98.6℃ 同源性＝100－{(98.6－65.0)/1.4}=83.1%

27 6、杂交液的成分 ： 反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，tm值可降低0.72℃。 6M尿素，降低Tm约30℃ 惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。 硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。

28 选用不同的封闭试剂：如Denhardt‘s试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO或block reagent , 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt's试剂相比, BLOTTO价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。

29 7、杂交的时间 在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行16h左右。 8、杂交液的体积：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。一般杂交液的用量为1ml/10cm2

30 七、洗膜时应注意的事项 1、洗膜的温度和SSC的浓度： Stringency: a term used in hybridization experiments to denote the degree of homology between the probe and the filter bound nucleic acid, the higher the stringency, the higher percent homology between the probe and the filter bound nucleic acid. （1）Non-stringent wash: 2xSSC, 65℃ Effective Tm＝ ( log0.33 )＋0.41( 45% )＝92.2℃ ％ homology ＝100－[ （92－65）/1.4 ]＝80.7% （2）Stringent wash: 0.1xSSC，65℃ Effective Tm＝ ( log )＋0.41( 45% )＝70.4℃ ％ homology ＝100－[ （70.4－65）/1.4 ]＝96.1%

31 2、洗膜的时间与次数： 一般用2XSSC洗1－2次，然后用严格的洗液洗2次，每次30分钟。

32 八、脱探针的方法及注意事项 ： 尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定保持湿润。 处理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100℃ 5－10分钟 DNA的膜还可以用0.2N NaOH处理

33 九、标记的方法 1、缺口平移法 （Nick Translation） 原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。

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35 2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。

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37 3、末端标记

38 （2）交换反应标记法

39 十、标记的种类 理想的标记物： ①具有高度的灵敏性 ②与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性 ③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉； ④若用酶促方法标记，应对Km影响不大

40 1、同位素 [α-32P]dNTP、[α-32S]dNTP用缺口平移法和随机引物法 γ-32P-ATP用于末端标记 放射性同位素（radiosotlope）是不稳定的，它会“变”。放射性同位 素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位 素，这就是所谓“核衰变”。 放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰 期”来表示。半衰期（half-life）即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一 半时所需要的时间。

41 同位素的特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性； ④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。

42 常用同位素的特征 同位素 符号 半衰期 β射线能量（MeV） 氢-3 3H 12.3年 0.018 碳-14 14C 5720年 0.156 磷－32 32P 14.3天 1.71 硫－35 35S 87.1天 0.167 碘－131 131I 8.05天 0.605

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44 2、非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存 方法：1.酶标记法 2.化学标记法
要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）

45 地高辛（Digoxigenin 简写Digo-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin –11-dUTP

46 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质—— Digoxigenin （DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是DIG胜于生物素(Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。

47 通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。 对于DIG 标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），过氧化物酶(peroxidase),荧光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是胶体金（colloidal gold）高亲和性的抗DIG抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。

48 DIG 系统的优势： （1）高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度向媲美 （2）曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程 （3）安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染 （4）探针可重复使用，最少可以稳定储存一年 （5）可轻松进行探针拨离和重探

49 检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭物显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗DIG 抗体为例：即可以使用NBT或BCIP做底物的显色法，也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到0.1pg

50 常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系，以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。

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52 DIG标记的dUTP代替部分dTTP掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同时释放出光子，可用X-光片显示杂交信号。