第七章 蛋白质与氨基酸的测定 CHARTER 7 Determination of protein and amino acid in Food 7.1 概述 7.2 蛋白质的测定方法 7.3 食品中氨基酸的测定.

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1 第七章 蛋白质与氨基酸的测定 CHARTER 7 Determination of protein and amino acid in Food
7.1 概述 7.2 蛋白质的测定方法 7.3 食品中氨基酸的测定

2 7.1 概 述 “蛋白质是生命的物质基础，生命是蛋白质存在的一种形式” 。
7.1 概 述 “蛋白质是生命的物质基础，生命是蛋白质存在的一种形式” 。 蛋白质是由-氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。 蛋白质是由-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万~数百万，分子的长轴则长数nm~数百nm。 蛋白质的元素组成（The elements of protein） C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 基本结构单位：-氨基酸 蛋白质的变性作用 肌红蛋白的三维结构

3 人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。
蛋白质是食品中最重要的营养素之一，是体内唯一的N源。人和动物从食物中摄取N，不是直接吸收蛋白质。 完全蛋白质又称优质蛋白质，指含有足够量的全部必需氨基酸且比例恰当，既能维持生命，又能促进生长，如人乳、牛奶、肉、鸡蛋中的蛋白质。 半完全蛋白质必需的氨基酸的种类齐全，总量丰富但是比例不太恰当，或者是含量不足，仅能维持生命，如廋肉、大豆、干果、谷类等的蛋白质。 不完全蛋白质是缺乏某种必需的氨基酸或者是含量不足，如玉米蛋白、大麦蛋白、豌豆蛋白和动物皮、骨中的胶原蛋白等属于不完全蛋白质，营养价值相对较低。 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。

4 部分食品中蛋白质的含量 食物名称 蛋白质含量（以湿基计）/% 猪 肉（肥瘦） 9.5 稻米 8.3 牛 肉（肥瘦） 20.1 小麦粉（标准)
9.9 羊 肉（肥瘦） 11.1 小米 9.7 马肉 19.6 玉米 8.5 驴肉 18.6 大豆 36.3 兔肉 21.2 大白菜 1.1 牛乳 3.3 油菜（秋） 1.2 乳粉（全） 26.2 油菜（春） 2.6 鸡 21.5 菠菜 2.4 鸭 16.5 黄瓜 0.8 鸡蛋 14.7 苹果 0.4 大黄鱼 17.6 桃 小黄鱼 16.7 柑桔 0.9 带鱼 18.1 鸭梨 0.1 鲐鱼 21.4 鲤鱼 17.3

5 7.2 蛋白质的测定方法 蛋白质分析测定的重要性 生物活性测定 功能性质调查 营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值

6 蛋白质直接测定含量很困难，可以通过测定氨间接推算其含量，是目前最常用的蛋白质测定方法
NH3 蒸馏 滴定 Pr 消化 测氨定氮 推算出蛋白质 蛋白质含量%=F×氮的含量% F：称为蛋白质系数。 一般蛋白质含氮量为16％，即1份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、牛乳及其制品为6.38，混合、未知来源的6.25。

7 关于氮--蛋白质换算系数  6.25 = 6.25 = = 6.38 5.95

8 蛋白质定量方法 定氮法（凯氏法、杜马法） 双缩脲法(测定肽键) 物理法（比重、折光、旋光等方法）
利用蛋白质共性的方法 定氮法（凯氏法、杜马法） 双缩脲法(测定肽键) 物理法（比重、折光、旋光等方法） 仪器分析法（UV、IR、HPLC、HPCE及联用技术HPLC、HPCE与质谱 ） 利用特定氨基酸残基法 染料结合法 福林—酚试剂法（Lowr 法 ）

9 凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出， 方法分类：根据测定仪器和测定范围可分为常量法、微量法、自动定氮仪法。
介绍GB 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定 第一法 凯氏定氮法 原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。硫酸钾为增温剂，提高溶液沸点。硫酸铜为催化剂、消化终点指示剂。

10 第二法 分光光度法 原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量.结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 第三法 燃烧法 原理：试样在 ℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测器(TCD)进行检测。

11 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：
一、 样品消化：消化反应方程式如下 2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 + 6CO2 ↑+ 12SO2 ↑ +6H2O (消化一) 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫： 2H2SO4 + C = 2SO2 ↑ + CO2 ↑ + 2H2O (消化二) 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中： H2SO4 + 2NH3 ＝ (NH4)2SO (消化三) 二、 蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH + (NH4)2SO4 = 2NH3 ↑十 Na2SO4+ 2H2O (碱化、蒸馏)

12 三、吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行叹收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性(Ka1= 5
2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O (吸收) (NH4)2B4O7 + 5H2O + 2HCl = 2NH4C1 + 4H3BO (滴定) 蒸馏释放出来的氨，也可以采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算出总氮、蛋白质的量。

13 几种蛋白质测定方法比较 凯式定氮法 双缩脲 杜马斯 福林-酚 凯式定氮装置 分光光度计 高温装置、GC 分光光度计 用量较少 不需要
原理 装置 溶剂 时间 灵敏度 干扰 总氮量 蛋白氮 总氮量 蛋白氮 凯式定氮装置 分光光度计 高温装置、GC 分光光度计 浓硫酸 用量较少 不需要 福林-酚试剂 长 简单快速 3min 简单快速 较低 低 高 较小 有干扰 酸类及柠檬酸类

14 食品分析实验 食品中蛋白质的测定—凯氏定氮法 （ 必做，参照GB/T 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定）

15 7.3 食品中氨基酸的测定 氨基酸（amino acid）是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然物中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它们一般分成必需氨基酸和非必需氨基酸两类， 必需氨基酸：人体中不能合成，合成速度不能满足人的需要必须依靠食品供给的氨基酸如色氨酸(Tryptophan Try)、赖氨酸(Lysine Lys)、蛋氨酸(Methionine Met)、苯丙氨酸 (Phenylalanine Phe)、苏氨酸(Threonine Thr)、缬氨酸(Valine Val)、组氨酸(Histidine His)、亮氨酸(Leucine Leu)及异亮氨酸(Isoleucine Ile)等9种氨基酸。 非必需氨基酸种类：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、胱氨酸（Cys）、半胱氨酸（1/2Cys）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Glu）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyd）。

16 氨基酸含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。
是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。 氨基连在-碳上的为-氨基酸。 组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸。

17 食品中氨基酸分析方法概要 氨基酸总量的测定（甲醛滴定法、茚三酮分光光度法、非水滴定法）
食品中氨基酸的组分测定（氨基酸自动分析仪法、HPLC-UV柱后衍生法）

18 氨基酸总量的测定 双指示剂甲醛滴定法 原理：氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式如下： 方法特点：简单易行、快速方便，如果样品中只含有某一种已知的氨基酸；可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物(如蛋白水解液)，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但一般常用此法测定蛋白质水解程度，当水解完成后，滴定值不再增加。脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羟基，滴定时要消耗一些碱，使结果偏高；溶液中若有铵，使结果偏高。此法适宜浅色至无色的样品。

19 氨基酸总量的测定 双指示剂甲醛滴定法 原理：氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式如下： 方法特点：简单易行、快速方便，如果样品中只含有某一种已知的氨基酸；可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物(如蛋白水解液)，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但一般常用此法测定蛋白质水解程度，当水解完成后，滴定值不再增加。脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羟基，滴定时要消耗一些碱，使结果偏高；溶液中若有铵，使结果偏高。此法适宜浅色至无色的样品。

20 食品中氨基酸的组分测定 依据GB/T 5009.124-2003 食品中氨基酸的测定
适用于食品中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、绷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。LOD 10 pmol。不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。 日立L-8900型氨基酸自动分析仪

21 原理：食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液（135℃）产生颜色反应，再通过分光光度计比色（440nm （浅黄色）、570nm（蓝紫色））测定氨基酸含量。 新型氨基酸自动分析仪可以同时测定食品中18种以上氨基酸。

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23 复习思考题 何谓蛋白质转化系数？在蛋白质的含量结果计算中为什么要乘以蛋白质转化系数？ 简述凯氏定氮法的三个主要操作步骤及相应的注意事项。
简述氨基酸总量的测定方法。 简述氨基酸自动分析仪定量测定氨基酸组分的原理。