第六章 多倍体与单倍体植物.

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1 第六章 多倍体与单倍体植物

2 无籽葡萄 西柚：葡萄柚（无核） 美国多倍体大花萱草 枣多倍体 碧桃：桃的多倍体 四倍体巨型草莓 多倍体紫芦笋 多倍体扇贝、牡蛎

3 本讲主要内容： 1.多倍体育种 2.单倍体育种 本讲关键问题： 多倍体形成的原理与方法

4 染色质（Chromatin）是指细胞分裂间期遗传物质的存在形式。
知识回顾 染色质（Chromatin）是指细胞分裂间期遗传物质的存在形式。 染色体（Chromosome）是指细胞有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚成的棒状结构。 染色质（Chromatin）和染色体（Chromosome）是同一物质在不同的细胞周期中不同的形态表现。 人类染色体

5 几个基本概念 1.染色体组（Chromosomeset/Genome）
生物体配子的全部染色体称为一个染色体组。同一物种的染色体数目是相对稳定的。配子染色体为单倍体（Haploid），用n表示，称为一个染色体组。体细胞为二倍体（Diploid）以2n表示。 多数生物体是二倍体：体细胞中染色体是两两成对的。例如，果蝇有4对共8条染色体(如图)，这4对染色体可以分成两组，每一组中包括3条常染色体和1条性染色体。

6 2.整倍体（euploid） 体细胞内含有完整的染色体组的类型为整倍体。以小麦属为例。多个种的配子染色体数（n）都是以7个染色体为基数变化的。普通小麦n=21，2n=42是7的六倍 3.非整倍体（aneuploid） 体细胞内的染色体数目不是染色体组的完整倍数的称为非整倍体。多或少一个以至若干个染色体。

7 4.染色体变异 染色体变异可体现在染色体数目和结构两个方面。 染色体数目能以个体或以染色体组为单位的增加或减少。 染色体组数量改变：成倍性增减。 个体改变：一个细胞中的染色体数和正常二倍体的染色体数相比，出现了不规则的增多或减少，即为非整倍体畸变。

8 5.染色体工程 按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的目的的技术。 广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。

9 第一节 多倍体育种 一 定义 多倍体（polyploid）：是指个体细胞中含有超过正常染色体组数的个体。是由Winkler于1916首先使用的。 同源多倍体（autopolyploid）：多倍体的染色体来自于同一物种或在原有染色组的基础上加倍而成。 异源多倍体（allopolyploid）：多倍体的染色体来自于不同一物种。自然界中存在的多倍体大多是异源多倍体。 常见多倍体有三、四、五、六和八倍体。在被子植物中，至少有1/3的物种是多倍体。例如，普通小麦、棉花、烟草、苹果、梨、菊、水仙等都是多倍体 。马铃薯是四倍体 ，普通小麦是六倍体 。

10 二 特点 （1）形态上的巨大性 （2）优良性状：光合效率提高、生长速度快、营养成分提高等。
（3）抗病能力强：在对逆境的耐抗性方面会得到增强。 例如：三倍体桑树：表现为体细胞较大、叶肉厚、叶色深、叶质较好、抗寒性增强。 花卉：三倍体花器官增大、色彩更鲜艳，同时还能使花期延迟，大大提高了花卉的观赏价值和商业价值。 三倍体鲍鱼：具有高度不育性，因而使体细胞生长方面的能量相对增加，增强了鲍鱼的抗逆性和抗病能力，提高了生长速度。此外，还可以延长鱼类寿命、控制过度繁殖。

11 问题1：为什么多倍体高度不育呢？ 联会(synapsis) 同源染色体配对称为联会，是在减数分裂的偶线期两条同源染色体侧面紧密相帖并进行配对的现象。形成一个四分体。

12 以有3个染色体的三倍体为例，3n(n=3) 在同源染色体联会时可能有四种取向的排列方式： 四种中只有A形成的配子具有完整染色组的单倍体或者二倍体完整染色体的配子。占25%。 其余3种组合所形成的配子都是非整倍体染色体的配子， 这种配子由于剂量不同，一般不成活。

13 一般形成正常配子的几率是1/2（n-1），这里n
是一个染色体组中的染色体个数。如果是6对以上染色体，三倍体几乎全部不育。 减数分裂时同源染色体联会时发生紊乱，很难 将完整的一套染色体分配到一个配子中去。 即：很难形成具有完整一套染色体组的配子。绝大多数配子中的染色体数目不正常。 香蕉是三倍体，由于染色体的配对发生紊乱， 从而不能正常地进行减数分裂，不能产生种子， 只能通过无性繁殖繁衍后代。传统的无性繁殖 往往通过地下球茎中的不定芽培育成苗。

14 问题2：三倍体高度不育有什么好处呢？ 食用方便：三倍体的西瓜因为很少产生有功能的生殖细胞，所以没有种子，无籽西瓜。食用方便，且含糖量高。利用的是三倍体高度不育性： 生物安全：可以户外人工种植或养殖，与正常品种一起。 其他优良性状：巨大、花期长等。三倍体的杜鹃花因为不育，所以开花时间特别长。抗逆、生长快、寿命长等。

15 植物多倍体现象普遍，多为异源多倍体。Grant(1971)
估计，多倍体的频率： 被子植物中占47%，其中双子叶植物占43%，单子叶植 物占57% ，禾本科植物大约有2/3是多倍体。 在裸子植物中占38%，在松柏科植物中仅占1.5%，在 蕨类植物中占95%。 动物多倍体少，并多为同源多倍体。例如： 甲壳类中的一种丰年鱼为四倍体； 线形动物中的马蛔虫为同源四倍体(4n=4)； 昆虫（孤雌生殖）：双翅目毛蠓科有三倍体的毛蠓；膜 翅目的叶蜂科有四倍体的雌蜂。

16 问题3：为什么动物的多倍体比植物少？ 植物： （1）大多数植物是雌雄同体或雌雄同花的，它们的精原细胞和卵原细胞可能同时发生不正常的减数分裂，使配子中染色体数目不减半，这种配子通过自体受精而自然形成了多倍体。 （2）植物的繁殖比较容易，如果多倍体植物不能形成种子，它还能依靠营养器官的无性繁殖来产生后代，因此在生物进化过程中，植物多倍体有可能被保存下来。 动物： （1）高等动物的远源杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体。 （2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡，因此很难得到多倍体的子代个体。

17 三 多倍体产生原理与诱导方法 1.植物多倍体 （1）产生原理
主要是体细胞在有丝分裂的过程中，染色体完成了复制，但是细胞受到外界环境条件(如温度骤变)或生物内部因素的干扰，纺锤体的形成受到破坏，以致染色体不能被拉向两极，细胞也不能分裂成两个子细胞，于是就形成染色体数目加倍的细胞。

18 （2）诱导方法 A 化学方法 细胞松弛素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞分裂。 秋水仙素：分子式为C22H25O6•12H2O，是从一种百合科秋水仙属植物器官中提取的一种生物碱。能特异性地与细胞中的微管蛋白质分子结合，从而使正在分裂的细胞中的纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法向细胞两极移动，最终形成染色体加倍的核。细胞可以在药剂去除后恢复正常分裂。

19 秋水仙素处理方法 处理部位：只有处理正在分裂的细胞才能获得多倍体。通常以植物茎端分生组织或发育期的幼胚为材料。
处理方式：秋水仙素一般用水溶液，选择以下处理方法：浸渍法、涂抹法、棉花球滴渍法、喷雾法、注射法、药剂培养基法等。

20 药剂浓度：不同植物对秋水仙素的敏感性不同。实践证明，秋水仙素的有效浓度一般在0.01-0.4%，以0.2%左右的浓度最为常用。
处理时间：一般不少于24小时。浓度高时处理时间可相应短些。 处理温度：一般在18-25℃之间。

21 B 生物方法 （一）杂交法 生物学方法主要指体细胞杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交繁殖多倍体后代，经常与化学与物理方法结合使用。
异源多倍体一个代表性的例子是人工培育的小黑麦，它是由小麦（6（6n=42，AABBDD）和黑麦（2（2n=14，RR）杂交而成的。普通小麦的染色组是ABD，黑麦的染色体组是R，最后获得的杂种的染色体组是ABDR。 异源多倍体（21+7）子一代不育，但只要将它的染色体加倍(42+14)，这样就能顺利地进行减数分裂而形成正常的雌雄配子，变为正常可育。培育出的八倍体小黑麦具有许多新的特点，形态上像小麦，但穗子、籽粒显著大于小麦，同时能抗寒冷、干旱、贫瘠等不良条件，在高寒地区和盐碱地区具有一般小麦不具有的优势，而且增产效果较明显，营养价值（如蛋白质）也有了较大改善。

22 B 生物方法 （二）胚乳培养法 被子植物胚乳是由3个单倍体核融合而成，其中1个单倍体核来自雄配子体，2个来自雌配子体，因此被子植物胚乳一般有3个染色体组。胚乳具有细胞全能性，可得到三倍体植株。

23 四、多倍体倍性的鉴定 人工诱导不能百分之百地成功诱导出多倍体，处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体，所以需要鉴定染色体的倍性，从中筛选出需要的多倍体。 常用的多倍体倍性鉴定鉴定方法有用间接法（如核体积测量、形态学检查等）和直接法（如染色体计数以及DNA含量测定等）两类。 （1）核体积测量法：一般而言，细胞核大小与染色体数目成比例，为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此多倍体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。因此，通过体细胞核体积的测定可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。

24 （2）染色体计数法：将细胞固定制片、染色后观察染色体个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目前鉴定多倍体倍性的一种直观、准确的方法，缺点是比较费时。
（3）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定方法。可以测定单个细胞的DNA含量，再根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。

25 五、三倍体培育应用举例 举例1：三倍体西瓜培育 ——同源多倍体代表性的例子 无籽西瓜的果实由于没有籽、品质好、
食用方便、高产抗病、耐贮运等优点而 深受欢迎。

26 原理 普通西瓜为二倍体植物，即体内有2组染色体（2n＝22）。
如用秋水仙素(一种植物碱)处理二倍体西瓜的种子或幼苗，使其在细胞分裂的中期，阻碍纺锤丝和初生壁的生成，使已经复制的染色体组不能分向两极，并在中间形成次生壁。结果就形成了染色体组加倍的细胞，使普通二倍体西瓜染色体组加倍而得到四倍体西瓜植株。 然后与二倍体西瓜植株 (作为父本)杂交，从而得到三倍体种子。三倍体的种子发育成的三倍体植株，由于减数过程中，同源染色体的联会紊乱，不能形成正常的生殖细胞。再用普通西瓜二倍体的成熟花粉刺激三倍体植株花的子房而成为三倍体果实，因其胚珠不能发育成种子，因而称为三倍体无籽西瓜。

27 原理 子房发育成果实，胚珠发育为种子。在子房发育成为果实的过程中，需要一定量的生长素。
生长素在植物体内的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子。在二倍体西瓜的花粉中，除含有少量的生长素外，同样也含有使色氨酸转变成生长素（吲哚乙酸）的酶系。 三倍体无籽西瓜因为不形成种子，所以缺乏由幼嫩种子产生的生长素，所以要刺激子房发育成果实，就要授以成熟的花粉。 把三倍体和二倍体相间种植，以保证有足够的二倍体植株的花粉传到三倍体植株的雌花上去，提供生长素。

28 步骤 （1）四倍体母本的获得： 用0.2～0.4％的秋水仙素液体将二倍体普通西瓜的种子浸泡12～24小时，或在每天下午6～7点钟用 0.22～0.44％的秋水仙素液体滴在其幼苗茎尖生长点上，连续进行四天。令二倍体西瓜植株细胞染色体成为 4倍体（4n＝44），这种4倍体西瓜能正常开花结果，种子能正常萌发成长。

29 （2）处理后的种子或幼苗，要用清水洗干净。处理及缓苗期间，应将植株置于散光下，以免日光直接照射，致使秋水仙素分解破坏。同时亦切忌高温，因为在高温情况下，秋水仙素对植物的毒性增强，容易造成死苗。因此，在成活前应给予良好的栽培条件和精心管理。

30 （3）多倍体的鉴定： ①用秋水仙素溶液处理后，应注意观察多倍体植株。若形成多倍体，它萌芽的肥厚度明显增加，幼根尖端发生膨大现象； ②考察植株的体型，多倍体具有体型较大的特点。如叶片较大，根茎变粗，花、果实、种子都较大，茎叶组织比较粗糙，颜色深绿，有时有皱缩现象； ③四倍体叶面的气孔较大，单位面积气孔数目相对减少，花粉粒较二倍体的花粉粒大一倍以上； ④为了鉴定的准确起见，尚须直接在显微镜下检查染色体数目是否已经加倍(普通二倍体西瓜2n=22，四倍体西瓜4n= 44)。

31 （4）三倍体西瓜制种：用四倍体西瓜作母本，授以二倍体的花粉粒，结出三倍体的西瓜种子(存在于四倍体的子房发育成的西瓜中)。
小面积制种，按照西瓜开花习性，在每天下午按时套袋(防止自由传粉)。第二天早晨进行人工授粉，同时挂上标记。大面积制种时则需要分区隔离，按一定比例培植四倍体母本和二倍体父本的植株，且要及时为母本去雄使四倍体植株接受二倍体父本植株的花粉，以产生三倍体种子备用。

32 （5）在第二年，将三倍体种子与二倍体种子间种，自然或用人工的方法，让二倍体花粉刺激三倍体植株的子房发育成西瓜，即成三倍体无籽西瓜。
在大田生产中三倍体种子也可以不与二倍体种子间种，而是只种三倍体种子。在其植株开花期间，用低浓度2.4-D( 二氯苯氧乙酸)喷洒在花蕾上，使子房发育成无籽西瓜果实。

33 第一年得到的西瓜应是四倍体西瓜，其中的种子是三倍体的。确切地说，该种子的胚是三倍体的，而种皮则是四倍体的(该种皮由四倍体的珠被发育而成)。
第二年得到的西瓜才是三倍体西瓜，其内无籽确切地说是只有种皮(三倍体的胚珠发育而成) 而无胚(授粉不受精，不能形成受精卵，因而无胚）。

34 第二节 单倍体植物 一、定义 单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数，即具有配子染色体数目的个体。 思考题4：单倍体是不是就是一倍体？
水稻是二倍体,其单倍体是一倍体(n=x=12) 普通烟草是异源四倍体，单倍体是二倍体（n=2x=Ts=24） 普通小麦是异源六倍体，单倍体是三倍体（n=3x=ABD=21）

35 二、特点 二倍体杂合植物两套染色体： 显性基因（dominant gene）：控制显性性状发育的基因。在二倍体生物中，杂合状态下能在表型中得到表现的基因。 隐性基因：支配隐性性状的基因。在二倍体的生物中，在纯合状态时能在表型上显示出来，但在杂合状态时就不能显示出来的基因。 由于单倍体只具有一套染色体，染色体上的每个基因都能表现相应的性状，所以极易发现所产生的突变，尤其是隐性突变，所以单倍体是进行染色体遗传分析的理想实验材料。 由于通过人工方法使单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体，因此在育种上具有极高价值。

36 思考题5：单倍体是否也高度不育呢？ 由配子产生的个体高度不育，原因是配子中的染色体减数分裂时随机向两极移动,只有到达一极的染色体完全时,配子才是可育的。 在减数第一次分裂的中期，它们的染色体都是单倍体，没有可以配对的同源染色体，是被随机的分向两极，每一条染色体分到这一极或那一极的机会都是1／2 (n-1)，例如：对于一组的12条染色体都分到一极的机会是 1／1024，可见单倍体是高度不育的。

37 三、单倍体产生原理与方法 假受精：远缘花粉刺激未受精卵细胞分裂发育成单倍性的胚。
组织培养：花药、花粉（雄配子）、未授粉的子房胚珠（雌配子）的培养。 雄核发育(Androgenesis)或孤雄生殖：卵细胞不受精，卵核消失，或卵细胞受精前失活，由精核在卵细胞内单独发育成单倍体，因此只含有一套雄配子染色体。这类单倍体的发生频率很低。 雌核发育(Gynogenesis)或孤雌生殖：精核进入卵细胞后未与卵核融合而退化，卵核未经受精而单独发育成单倍体。

38 四、植物单倍体与纯合二倍体 花药和花粉培养（Anther and pollenpulture）指离体培养花药和花粉，形成花粉植株，从中鉴定出单倍体植株并使之二倍化的细胞工程技术。 由于花粉（雄配子，n）的染色体只有体细胞的一半，因此获得的植株是单倍性的。

39 杂↓交 DdTt 得到种子为第一年） 减 数 分 裂 DT Dt dT dt 花药—精子（雄 配子） ↓ 花药↓ 离体↓培养↓ ↓
1.利于得到纯合体——单倍体加倍、后代性状一致，利于加快纯 合的二倍体的筛选时间。 2.直接从杂交的优良品系的花粉培养筛选，减少优良品系筛选时 间 3.利于筛选隐性突变体，提高诱变效率 DDTT × ddtt 杂↓交 DdTt 得到种子为第一年） 减 数 分 裂 DT Dt dT dt 花药—精子（雄 配子） ↓ 花药↓ 离体↓培养↓ ↓ DT Dt dT dt 单倍体 ↓秋水 ↓仙素 ↓处理↓单倍体幼苗） DDTT DDrr ddTT ddtt 纯合体

40 4.利于获得优良植株： 例如：芦笋是一种耐寒多年生蔬菜，属于百合科。提供了丰富的碳水化合物，维生素A，核黄素，烟酸，维生素B1，磷。 芦笋雌雄异株植物，XX、XY。雄株生长旺盛，枝叶茂密，发茎数多，品质好，产量高，雌株枝叶稀疏，发茎数少，产量低。因此培育全雄系成为芦笋育种的首选方向。 利用花药培养可以很快获得雄性（YY）芦笋

41 举例2：花药培养生成单倍体加倍小麦的过程 1、花粉的获得：剪下小麦穗子。
2、花药制备与培养：剪掉叶子，只留叶鞘，将穗子插入有水的烧杯，放在4℃冰箱预先处理3-5天。然后用70%的乙醇擦拭叶鞘，在无菌条件下剥取花药，接种于适当的培养基中，25-28℃条件下培养。

42 3 愈伤组织诱导与增殖培养：当愈伤组织长到1.5-2.0毫米时转移到含奈乙酸、蔗糖等成分的培养基上，于25℃、光照条件下培养。
4 移栽：当愈伤组织长出根系后，把苗从培养基中取出，移栽于土壤中。 染色体加倍获得二倍体：当花粉植物处于分蘖盛期时，从土壤中取出植株，浸入0.02%的秋水仙素溶液中，于10-15℃下、散射光照处理2-4天，洗去药液，栽入土中。筛选得到二倍体小麦。

43 五、单倍体筛选 1.形态鉴定：简单直观但形态标记数量少，鉴定的准确性低 2.结实性鉴定 3.染色体数目鉴定
4.生化标记鉴定：常用同工酶标记。受环境影响小，检测也是相对简便，但生化标记数量少，受到一定限制。 5.分子标记鉴定：现常用SSR、STS、RFLP、RAPD、 AFLP。

44 六、纯合二倍体植物 经染色体加倍后产生纯合二倍体，再经过田间育种试验，获得优良新品种。单倍体育种可以缩短育种年限，提高选育效果。
1.自然加倍（花粉植株并不象预期都是单倍体。） 2.人工诱导加倍（一般用秋水仙素处理） 3.从愈伤组织再生二倍体植株

45 本节小结： 多倍体定义、特点、产生原理与诱导方法 单倍体定义、特点、纯合二倍体培育 上节预习思考题讨论： 与体细胞杂交育种的区别？