成熟B细胞通过去分化成一种未定型祖细胞而转化为T细胞

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1 成熟B细胞通过去分化成一种未定型祖细胞而转化为T细胞
Conversion of mature B cells into T cells by dedifferentiation to uncommitted progenitors 成熟B细胞通过去分化成一种未定型祖细胞而转化为T细胞 朱海强

2 Abstract Lineage commitment and differentiation to a mature cell type are considered to be unidirectional and irreversible processes under physiological conditions. 造血祖细胞可以在Pax5基因的一定作用下定向分化为B细胞系，并且在危急时，在Pax5基因所编码的转录因子的作用下可以转变为成熟B淋巴细胞 去除Pax5 外周淋巴组织的成熟B细胞 未定型祖细胞 In vivo T lymphopoiesis In thymus dedifferentiate

3 1、携带有免疫球蛋白的重、轻链 2、具有T细胞进行免疫反应的各种功能 T lymphopoiesis In thymus 成熟B细胞缺失Pax5基因的鼠 长出侵入性淋巴瘤块 1、完全缺失Pax5的晚期B细胞可以初始淋巴瘤的产生 2、尽管外周B细胞为成熟的分化细胞，却仍然具有不稳定性（可塑性）

4 用特异性缺陷确定细胞是我们需要的细胞 死 活 脾脏肿大和大块的淋巴结
将仅在外周淋巴组织里的B cell的 B-cell-specific Cd19-cre gene有效的去除了被标记(简写为fl)的Pax5等位基因。这些去除Pax5等位基因的细胞用来分析Cd19-cre Pax5fl/- mice中的成熟的B cell的Pax5基因的功能。 Eμ-bc12 Cd19-cre Pax5fl/- 脾脏肿大和大块的淋巴结 死 Cd19-cre Pax5fl/- 活 Cd19-cre Pax5fl/+ 说明了Pax5基因在祖细胞分化为B cell方面有重要影响作用。单等位基因的细胞能产生淋巴瘤。

5 脾脏肿大和大块的淋巴结 liver kidney thymus lung

6 - +

7 B cell特异的 Lymphocyte progenitor 是被Pax5抑制的基因

8 为了检测 右图：Summary of the V(D)J recombination analysis. The PCR fragments corresponding to the rearrangements of the tumours shown in left photo were cloned and sequenced to determine the reading frame of the individual rearranged Ig alleles. n.d., not detected; oc, oligoclonal.

9 1、所有的tumours中都发现有片段重组和存在Ig h的表达，说明是这些tumours源自于之前移植的细胞
1、所有的tumours中都发现有片段重组和存在Ig h的表达，说明是这些tumours源自于之前移植的细胞.很多的tumours里面发现有片段重组的Ig k和Ig l的存在。 这不同于被删除Pax5的pro-B cell，pro-B cell是不能产生VHJ558-DJH 和VК-JК重组体的。 2、这些late pre-B cell则产生了最初开始阶段就有的功能免疫球蛋白的重、轻链重组体。这个说明了在Cd19-cre Pax5fl/- mice身上的祖细胞淋巴瘤肯定是源自late pre-B 细胞，最大可能是来自于未成熟或者成熟的B cell 。确定了研究的目标细胞是未成熟的或者成熟的B cell，而不是B cell祖细胞。 pro-B cell是指B cell的祖细胞， late pre-B cell是指由pro-B cell分化的 B细胞，分为未成熟的和成熟的B cell 。

10 证明细胞存在的不稳定性，即在祖细胞、B细胞和T细胞之间变化的关系
In vivo with Cd19-cre Pax5 deletion In vitro with the CreED-30 transgene encoding a hormone-inducible Creoestrogen receptor fusion (Cre-ER) protein Anti-IL7Rα antibody (阻止B cell的生长) 限制了外周淋巴组织中的祖细胞和未成熟B cell生长分化成成熟B cell ，留下的就是成熟的B cell。（在注射入小鼠体内前经过40h的4 羟基三苯氧胺的浸泡，以去除呗标记有Pax5的等位基因的一些细胞）

11 8周后 Cd19-cre Pax5fl/- Eμ-bc12 Ly5.2 + mice
Cd19-cre Pax5fl/- Eμ-bcl2 Ly5.2+ mice CreED-30 Pax5fl/fl Eμ-bc12 Ly5.2 + mice Lin- CD25+ IgM+ IgD- cells（In vivo） Lin- IgM+ IgDhigh Mature B cells（In vitro） 8周后 Rag2-/- Ly5.1+ mice Bone marrow中检测到 Ly5.2+ c-Kit+ B220+ pro-B cells Ly5.2 + 和Ly5.1+是区别标记

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13 所有的Rag2-/- Ly5.1+ mice在移植入Pax5-deleted B cell后都能很好的长出重构后的T cell，这个正好证明了以前研究得出的源自骨髓的去Pax5祖细胞在胸腺里面长成T淋巴细胞的发现。不过数量上只有野生型的三分之一左右。 这些新的细胞能表达像正常的T cell一样的CD4+ CD8+、 CD4+ CD8- 、 CD4- CD8+ 、 CD4- CD8- 和出现了carried 多克隆 T-cell receptor-b gene (Tcrb) 重组体。并且用PCR分析重组的Ig h、 Ig k和 Ig I后确定这些细胞源自Ly5.2+ 的B cell。而且相对于野生T cell，这些双阳性的Ly5.2+ T cell 除了携带有VΚ-Jκ和Vλ-Jλ重组体之外还携带有独特的Ig h的单克隆的VH基因家族的VH-DJH 。

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15 通过将上面的实验分析我们知道，去除Pax5的成熟B cell在有限的几率下转变为未定型祖细胞，而最右边转移到Rag2-/- сγ-/- recipient mice中4周后用流式细胞分析得到b、c和d图结果，分析的说明B cell是先转移成祖细胞后再转移到胸腺等部位后重新形成T淋巴细胞的，而不是直接通过转分化为T cell的。

16 通过另外一个生长特点来区分进一步确定T cell是实验前的B cell转化而来的
B,流式细胞仪分析脾细胞，显示出的注射绵羊红细胞(SRBC)十天后的基因型。 C,B图中显示出的有相同免疫过的小鼠的生发中心的形成。

17 为了研究体内的B-cell-derived T cells我们使用了Tcra -/- mice作为移植体注射体外去除Pax5的成熟B cell。八个星期后这些 小鼠用绵羊红细胞(SRBC)进行免疫注射，十天后，用流式细胞技术和免疫组化分析了脾中的germinal-centre reaction，相比较Rag2 -/- mice,这些Tcra -/- mice有自然的B cell形态，仅仅没有产生CD4和CD8单阳性T cell。由于在脾脏中TCR-β+ T cell的缺失，这些Tcra -/- mice不能产生germinal-centre reaction和PNA + Fas + germinal-centre B cell。相比之下，这些重组的Tcra -/- mice包含了多克隆TCR-β+ T cell 。这些源自捐赠者的T cell能有效的诱导germinal-centre reaction和PNA + Fas + germinal-centre B cell （上图b、c）。显示出这些B-cell-derived T cell具有完全的功能。 生发中心 germinal center 在淋巴小结产生淋巴细胞时，有淋巴母细胞（成淋巴细胞lymphoblast）位于淋巴小结的中央部（称此为原始滤泡primary follicle），随着反复分裂而逐渐变小，遂成为淋巴细胞而被推向于淋巴小结的周边部位，这样在活泼的不断产生淋巴细胞的淋巴小结内，由于有处于分裂的淋巴母细胞占据中央部位，所以称此部位为生发中心或淋巴母细胞中心。另外由于该部有大型细胞聚集，与周边相比色调明亮所以又称为亮中心（light staining center），再有，由于相应于淋巴细胞形成的需要（例如抗原刺激）而引起分裂，所以又叫反应中心。据说与免疫记忆有关连。 B图：流式细胞仪分析脾细胞，显示出的注射绵羊红细胞(SRBC)十天后的 基因型。 C图：B图中显示出的有相同免疫过的小鼠的生发中心的形成。

18 谱系特异性转录因子的异常表达使细胞有一种形态转变为另外一种形态，有文献证明了在体外转分化的B淋巴细胞能转变为巨噬细胞，通过逆转录病毒的CCAAT/enhancer-binding protein-α的表达表现出来。此外，通过向人体皮肤细胞转入Oct3/4, Sox2, c-Myc 和 Klf4四个基因使其在体外改造成类似胚胎干细胞的“万能细胞”。相比较这些获得功能的实验而言，这个实验证明通过去掉单一的转录因子Pax5能使成熟的B cell在体内去分化为未成熟的造血祖细胞，然后发展成T cell。显示出了Pax5基因在B cell去分化中的重要作用，也说明尽管处在不同时期，B cell仍然是一种极度不稳定性的存在细胞。 致癌基因Pax5的染色体易位能使人体产生急性淋巴母细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤，一次广义上的分析有单等位基因的缺失或者Pax5的点突变的B cell祖细胞的实验体，结果显示32%出现了急性淋巴母细胞白血病。这些杂合基因说明Pax5突变杂合体能引起急性淋巴母细胞白血病。这个研究显示，在单Pax5等位基因的失活在缺失的致癌基因缺损还不足够诱导杂合的mice出现肿瘤。代之的Pax5的完全丢失却能产生淋巴瘤，因为Pax5 B细胞前体细胞在体内含有一种广泛意义上的自我更新潜能，这就像干细胞和致癌干细胞。这个缺失功能性的实验因此确定了Pax5基因在B淋巴细胞中系是一种肿瘤抑制基因。 北大校友俞君英造出“万能细胞” 意义相当首架飞机问世 据新华社报道，美国和日本大学的研究人员北京时间今晨分别发表论文，宣布成功把人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的“万能细胞”。其中在美国带领研究的是一名毕业于北京大学的中国科学家。 学界评价这一突破为生物科学的“里程碑”，同时可能意味着风靡一时的胚胎干细胞克隆技术退出舞台。 成果：皮肤细胞变“万能” 科学家把从人体上提取的皮肤细胞注入特定基因，成功改造成干细胞。由于这种干细胞能通过基因组合控制，因此有“万能细胞”、“变色龙细胞”之称，有望最终培育成人体组织或器官。 美日两国研究小组今晨分别在两家权威科学杂志上发表相关研究报告。美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森实验室的研究发表在《科学》杂志上，研究小组由中国科学家俞君英领导。 日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组把报告发表在《细胞》杂志上。 前景：可用于移植医疗 日本科学家山中伸弥在一份声明中说：“无需人类卵子或胚胎，我们现在有望制造出用于病人和疾病的特定干细胞。这些细胞有助于了解疾病机理、找出有效而安全的药物、用细胞疗法治疗病人。” 詹姆斯·汤姆森作出类似评估：“与人体胚胎细胞类似，这种人体万能细胞能应用于人体组织形成及功能研究、发现和试验新药、移植医疗等。” 在提及技术推广前景时，汤姆森说：“人们不知道这有多容易。美国数以千计的实验室基本明天就能做到。” 记者连线：北大学子领导研究 今天上午，本报记者联系到身在美国的中国籍科学家俞君英博士本人。 这次研究是由俞君英领导进行的。她说，这次的突破其实是一个新的开始，打开了人类更广范围利用细胞进行研究的新局面。 俞君英毕业于北京大学，是2003年到汤姆森研究室开始工作的，同时也开始了这个新项目的研究。 俞君英介绍,除了她之外，研究小组里还有其他中国研究员。 此外，威斯康星大学麦迪逊分校行政部工作人员今晨告诉本报记者，汤姆森实验室开始于1998年，由美国国家健康部门和地方基金会资助，有约17位研究员。 该实验室由曾经成功分离干细胞的美籍科学家汤姆森主持。 “万能细胞”产生过程： 1、提取细胞日本从一名36岁女性的脸部、美国从一名新生儿的阴茎包皮上提取皮肤细胞 2、注入基因把4种基因注入皮肤细胞，这些特定基因能够“重组”皮肤细胞的基因 3、改造成功普通人体皮肤细胞成功改造成干细胞 4、培育器官从理论上讲，这种干细胞的功能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干细胞，能够最终培育成人体组织或器官 俞君英人物简介： 姓名：俞君英 国籍：中国 学历：博士 籍贯：浙江诸暨 本科毕业院校：北京大学 出国时间：1997年留学院校：美国宾夕法尼亚大学 毕业时间：2003年 现工作单位：威斯康星大学麦迪逊分校汤姆森实验室职位：助理科学家 学界评价：意义相当于首架飞机问世 学界对这一研究给予高度评价。因为这种被称为“直接改造”的技术不仅能避免人体胚胎克隆技术引发的伦理争议，其高效、便利也为进一步医学应用打开了大门。 “我们现在可以设想这么一个时代：能够以一种简单方式制造干细胞，任何人身上的组织标本均能培育出任何组织器官。” ——世界首只克隆羊多利的“助产士”、英国科学家伊恩·威尔默特在一份声明中说。 “这项研究是一个了不起的科学里程碑。从生物学意义上讲，相当于莱特兄弟制造的首架飞机。” ——致力于人体胚胎克隆技术研究的美国细胞高级技术研究所首席科学家罗伯特·兰扎不惜溢美之辞。

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