病毒类疫苗生产技术.

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1 病毒类疫苗生产技术

2 病毒疫苗的一般制造方法

3 一　病毒类疫苗的制造方法 1　毒种的选择与减毒 毒株须具备的条件： （1）持有特定的抗原性； （2）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性； （3）易在特定组织中大量繁殖； （4）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；

4 （5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；
（6）未被其它病毒污染。 2　病毒的繁殖 （1）活体动物培养 （2）鸡胚培养 （3）组织培养

5 （4）细胞培养； 细胞培养时需要控制： ①　常用的维持液和生长液 　　需要氨基酸、辅酶、维生素、葡萄糖和无机盐等。 ② 培养条件控制 a pH值：7.0±0.2； b CO2提供：通过保持环境CO2分压5%，控制pH。

6 c 氧的提供：通氧； d 容器内壁洁净度控制：用硫酸－铬酸混合液洗涤，后用纯水冲洗； e 细菌污染控制：彻底灭菌，加入一定量抗生素； f 培养温度和时间控制：37±1℃，时间2－4天。

7 3　疫苗的灭活 　　用甲醛或酚溶液灭活。 　　动物组织对灭活效果有影响；灭活时间要合适。 4　疫苗纯化 　　细胞培养换液即可。

8 5　冻干 　　冻干的疫苗充氮或真空密封保存。

9 重要的病毒类疫苗生产工艺 一、甲型肝炎减毒活疫苗 历史： 绒猴肝内复制； 细胞培养未经纯化； 细胞培养经纯化。

10 二　乙型肝炎疫苗 　　HBsAg抗原具有较强的免疫原性，可制备疫苗，用酵母表达系统。

11 流行性感冒疫苗 生产工艺 世界卫生组织每年进行监测和预测。 要求：多价
将病毒接种于9~10日龄鸡胚胎尿囊腔中→32~34度培养48至80小时→收取尿囊液和羊水→蔗糖梯度离心（30至55%，25000r/min,15度，8h)

12 →灭活（－丙烯内酯1：6000，20℃,72h)

13 流行性乙型脑炎疫苗 　　以Vero细胞为基质，可用15L转瓶或50L微载体培养。毒种接种后培养3天开始收获病毒，每2天收1次，可收4至5次。收获液先用甲醛灭活，用超滤浓缩10至20倍，用硫酸鱼精蛋白处理，去除DNA。再进一步纯化：

14 方法一：蔗糖密度梯度离心 　　36%至60%蔗糖为介质，对粗制纯化产物进行速率离心，23000r/min4h，收集38%区带，除糖。 方法二：凝胶层析法 　　Sepharose CL-6B 去小分子，用Sephacryl S-500HR去大杂质。

15 第四节 乙型肝炎疫苗生产工艺 目前，乙型肝炎疫苗属于二代疫苗，即蛋白苗，乙肝表面抗原。 重组CHO细胞乙肝疫苗
第四节　乙型肝炎疫苗生产工艺 目前，乙型肝炎疫苗属于二代疫苗，即蛋白苗，乙肝表面抗原。 重组CHO细胞乙肝疫苗 　　将乙肝表面抗原基因拼接入CHO细胞染色体中。 　　培养细胞后收获培养液按如下纯化：

16 方法一：沉淀　超速离心　凝胶层析 　　用50%饱和度硫酸铵沉淀两次→用KBr等密度梯度离心→Sepharose 4B层析→洗脱。

17 方法二：三步层析法 　　第一步　Butyl-S-Sepharose FF 疏水层析； 　　第二步　DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析； 　　第三步　Sepharose 4FF凝胶层析。

18 纯化的抗原用甲醛（1：4000）37度72h，经微滤、超滤，加氢氧化铝吸附。

19 重组酿酒酵母乙肝疫苗 　　发酵后纯化方法同前。 用硅胶吸附→粗品→用疏水层析进一步纯化→微滤→加氢氧化铝吸附。

20 第五节　联合疫苗 联合疫苗：能够预防多种疾病的联合制品。