第十二章 食品添加剂的测定 §1 概述 一、 食品添加剂的种类

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1 第十二章 食品添加剂的测定 §1 概述 一、 食品添加剂的种类
第十二章 食品添加剂的测定 §1 概述 一、 食品添加剂的种类 食品添加剂 ——是指为改善食品品质和色、 香、味以及防腐和加工艺的 需要而加入食品中的化学合 成或者天然物质。 这些物质本身不作为食用目的，也不一定有营养价值。但不包括污染物、残留农药。

2 食品添加剂的种类很多， 按其来源 天然食品添加剂 化学合成添加剂 利用动、植物组织 通过一系列化学手段 或分泌物及以微生 所得到的有机或无机 物的代谢产物为原 物质。 料，经过提取、加 工所得到的物质。 如：Vc、淀粉糖浆、 植物色素等。

3 目前我国允许使用，并制订了国家标准《食品添加剂使用卫生标准》，分类有：
酸度调节剂、 抗结剂、 消泡剂、 抗氧化剂、漂白剂、 膨松剂、胶母糖基础剂、着色剂、护色剂、 乳化剂、 酶制剂、 增味剂、面粉处理剂、 被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、 稳定剂和凝固剂、甜味剂、增稠剂、食品香料、 其它 22类1500种（世界现在有4000多种）。

4 二、食品添加剂的安全使用和管理 天然食品添加剂一般对人体无害，大多数合成添加剂对人体有毒性，致癌物。要控制加入量。
关于人体每天允许食用量ADI值，可查书得到。

5 ADI——Acceptable Daily Intake For Man （由联合国粮农组织、世界卫生组织规定）
名称 ADI（mg / kg体重） NaNO ——0.2 苯甲酸 —— 5 山梨酸 —— 25

6 一些食品添加剂在不同的食品中添加的限量 添加剂名称 食品 加入限量（mg /kg) NaNO 午餐肉 NaNO 午餐肉 ＜ 500 SO 白糖 苯甲酸 干酪制品 山梨酸 果汁类 EDTA 果汁类

7 各种食品添加剂有自己的质量标准： （主要限制有害物质的含量）
例：山梨酸 GB EDTA二钠 GB2760—96 甜菊糖甙 GB 《食品添加剂中铅的测定方法》 GB/T —2003 《食品添加剂中砷的测定》 GB/T

8 三、食品添加剂检验方法 食品添加剂的检测也是先分离再测定。 分离——蒸馏法、溶剂萃取法、色层分离等。 测定——比色法、紫外分光光度法、TLC、 HPLC等。 测定的意义：为了保障食品安全！

9 §2 几种甜昧剂的检测 一、糖精钠的检测 糖精是应用较为广泛的人工甜味剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
§2 几种甜昧剂的检测 一、糖精钠的检测 糖精是应用较为广泛的人工甜味剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为： 难溶于水，故生产中常用糖精钠。 糖精钠—— 水溶性好，在酸性条件下溶于乙醚，热稳定性比糖精好，甜度为蔗糖的200—700倍。糖精钠、糖精对人体无营养价值，不分解、不吸 收，随尿排出，致癌性有争议，ADI值 0—2.5。

10 果酒、露酒、黄酒、啤酒、白酒、肉类、水产类、水果蔬菜类罐头中禁止使用糖精。 《食品添加剂使用卫生标准》规定：
婴幼儿食品、病人食品、主食中禁用。 果酒、露酒、黄酒、啤酒、白酒、肉类、水产类、水果蔬菜类罐头中禁止使用糖精。 《食品添加剂使用卫生标准》规定： 酱菜类、复合调味料、蜜饯、配料酒、 雪糕、冰淇淋、冰棍、糕点、饼干和面包， 糖精汁、果汁（味）型饮料 按稀释倍数 的80 %加入 用于瓜子 用于话梅、陈皮类 可与规定的其他甜味剂混合使用。 最大用量为 0.15 g/kg 1.2 g/kg 5.0 g/kg

11 美国香味和萃取物制造者协会规定，糖精最高参考用量为：软饮料72 mg/kg；冷饮150 mg/kg；糖果2100～2600 mg/kg，焙烤食品12 mg/kg。 GB/T 5009.28—2003）
HPLC 薄层色谱 离子选择电极 （一）HPLC法

12 1．原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH 至近中性，过滤后进高效液相色谱仪。经反相色谱分离后， 以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性，以其峰面积求出样液中被测物质的含量

13 2．色谱条件 检测器：紫外检测器，波长230μm， 灵敏度0．2AUFS； 色谱柱：YWG-C18 4．6mm×250mm，10um 不锈钢柱， 或其他型号 C18 柱 ； 流动相：甲醇+0．02mol/L 乙酸铵溶液（5+95）； 流速：1．0mL/min； 进样量：10μL。

14 4.说明与讨论 （1）本方法为国家标准分析方法（GB/T5009.28-1996），适用于各类食品中糖精钠含量的测定。取
样量为10mL, 进样量为10μL 时，最低检出限量为1.5ng。另外，本方法可同时测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量，其高效液相色谱图如图12-1。 （2）汽水和配制酒类要微热搅拌除去二氧化碳和乙醇，再用氨水（1:1）调pH 值约为7，加水定容，经0．45μm 滤膜过滤；饮料、果汁类用氨水（1:1）调pH 值约为7，加水定容，离心沉淀，上清液经0．45μm滤膜过滤。

15 （二）酚磺酞比色法 (一)原理 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标准系列比较定量。 (六)说明 ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。

16 ②苯甲酸等有机物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱以排除干扰。
（三）薄层色谱法 1.原理 在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，挥去乙醚后，用乙醇溶解残留物。点样于硅胶F254薄层板或聚酰胺薄层板上，展开后喷显色剂显色，再与标准比较。进行定性和半定量测定。在实验条件下糖精的Rf 值为0.3。计算公式如下：

17 （四）其他方法 1. 离子选择性电极法 糖精选择电极是以季铵盐所制PVC 薄膜为感应膜的电极，它和作为参比电极的饱和甘汞电极配合使用，可以测定食品中糖精钠含量。当测定温度、溶液总离子强度和溶液接界电位等条件一致时，测得电位遵守能斯特方程式，电位差随溶液中糖精离子的活度改变而变化，被测溶液中糖精钠含量在0.02～1mg/mL范围内时，电位值与糖精离子浓度的负对数成直接关系。 该法为卫生部推荐的参考方法。对苯甲酸的浓度为200～1000mg/kg 时无干扰；苯甲酸的浓度为50～500mg/kg，糖精钠的含量在100～150mg/kg 范围内，约有3%～10%的正误差，水杨酸和羟基苯甲酸酯堆苯法的测定有严重影响。

18 2.紫外分光光度法 样品经处理后，在酸性条件下用乙醚提取食品中的糖精钠，然后挥去乙醚，用乙醇溶解残留物。点样于硅胶GF254 薄层板或聚酰胺薄层板上，展开完毕后，硅胶GF254 板可直接在波长254nm 紫外灯下观察糖精钠的荧光条状斑。如用聚酰胺板，挥干后喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。把斑点连同硅胶GF254或聚酰胺刮入小烧杯中。同时刮一块与样品条状大小相同的空白薄层板，置于另一烧杯中做对照，经薄层分离后，溶于碳酸氢钠溶液中，经离心分离后，取上清液于波长270nm 下测定吸光度，与标准比较定量。 此法操作简单，精度高，可测定微量的糖精。

19 3. .纳氏比色法 利用糖精的溶解特性，先在碱性条件下用水溶解、浸取，再在酸性条件下用乙醚萃取，然后挥干乙醚，残渣在强酸性条件下加热水解，使糖精成为铵盐，与纳氏试剂作用生成一种黄色化合物，该化合物颜色深浅与糖精的含量成正比，可比色定量。此法操作简单，精度高，但干扰物质多。

20 4.荧光法 从样品中提取出糖精，在硫酸酸性条件下用高锰酸钾将干扰成分除去，于激发波长277nm，发射波长410nm 测定荧光强度，与标准比较定量。本法检测下限低，可测定微量的糖精，但干扰因素多，有待进—步完善。 5 气相色谱法 糖精难挥发，必须首先和甲基化试剂(碘化甲烷、重氮甲烷等)进行反应生成甲基糖精，然后用气相色谱法测定。 此法检测下限为10 mg/kg，回收率和重现性都很好。

21 二、介绍： 1. 阿斯巴甜（ASPARTAME） （蛋白糖）（合成） 学名：天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯 是天门冬氨酸 +苯丙氨酸组成的二肽甜味剂，甜度是蔗糖的180—200倍。在体内不需要胰岛素参与代谢，直接水解成两种氨基酸为人体吸收。

22 是一种以 L—天 冬氨酸 +D— 丙氨酸组成的二肽酰胺，甜度比蔗糖高 2000—2900倍，比糖精高 2—7倍，比甜蜜素高 50倍。
2. 阿力甜 （Alitame) 是一种以 L—天 冬氨酸 +D— 丙氨酸组成的二肽酰胺，甜度比蔗糖高 2000—2900倍，比糖精高 2—7倍，比甜蜜素高 50倍。 3. 甜蜜素 环己基氨基磺酸钠 （合成） 白色粉末，溶于水，对热、光、空气、碱稳定，甜度为蔗糖的 30倍。 NHSO3Na

23 4. 甜菊糖苷 （从甜叶菊中提取，可用于糖尿病人），甜度为蔗糖的 200——300倍。
4. 甜菊糖苷 （从甜叶菊中提取，可用于糖尿病人），甜度为蔗糖的 200——300倍。 这些甜味剂的检测主要有：HPLC法、分光光度计法等。

24 （一）环己氨基磺酸钠的检测 环己基氨基磺酸钠商品名为甜蜜素，是人工合成的非营养型甜味素，为白色针状、片状结晶或结晶性粉末，无臭，味甜，稀释溶液的甜度约为蔗糖的30 倍，对酸、碱、光、热稳定。摄食环己氨基磺酸钠后约40％从尿中排出，60％从粪便中排出。对其致癌作用引起了世界各国的争议，至今都没有达成一致看法。 1994 年FAO/WHO 对ADI 值规定为0~11mg/kg 体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》GB 2760~1996 规定环己氨基磺酸钠可用于酱菜、调味酱油、配制酒、糕点、饼干、面包、雪糕、冰淇淋、冰棍、饮料等，最大使用量为0．65g/kg；蜜饯，1．0g/kg；陈皮、话梅、话李、杨梅干，8．0g/kg。

25 1．原理 在酸性介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性定量。按下式计算： 式中： m──样品质量，g； V──进样体积，μL； A──测定用试样中环己基氨基磺酸钠的含量，μg； 10──正己烷加入量，mL。

26 2．色谱条件 色谱柱：不锈钢柱，长2m，内径3mm； 固定相：Chromsorb WAW DMCS 目，涂以10% SE-30； 温度：柱温80℃；气化室150℃；检测器150℃； 流速：氮气40 mL/min；氢气30 mL/min；空气300 mL/min。 3.说明与讨论 （1）含二氧化碳的样品需经加热除去，含酒精的样品加氢氧化钠溶液调至碱性，于沸水浴中加热以除去酒精。 （2）环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠的反应必须在冰浴中进行。

27 （二）乙酰磺胺酸钾的检测 乙酰磺胺酸钾又名安赛蜜，对光、热（225℃）均稳定，甜感持续时间长，味感优于糖精钠。经动物毒性试验证明，本品是安全的。FAO／WHO 于1997 年规定其ADI 值为0~15mg/kg 体重。乙酰磺胺酸钾主要用于：果脯、奶类饮品、水果类甜点、果酱、口香糖、浓缩果蔬饮料、酒类、蛋类甜食、减肥营养配方、啤酒和麦乳精饮料等。

28 1．原理 样品中乙酰磺胺酸钾经高效液相反相柱C18 分离后，以保留时间定性、峰高或峰面积定量。按下式计 算：
式中： c──由标准曲线上查得进样液中乙酰磺胺酸钾的含量，mg/mL； m──样品质量，g； V1──样品稀释液总体积，mL； V2──HPLC 测定时进样的体积，mL。

29 2.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为214nm； 分析柱：大连化物所生产的4．6mm×150mm，粒度5μm ，Spherisorb C18 柱； 流动相：0．02mol/L 硫酸铵（740～800mL）+甲醇（170～150mL）+乙腈（90～50mL）+10% H2SO4（1mL）； 流速：0．7mL/min。 3.说明与讨论 （1）本方法可同时测定乙酰磺胺酸钾、糖精钠、咖啡因、天门冬酰苯丙氨酸甲酯，检出限为0.004 mg/mL。 (2) 样品须温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气。通过微孔滤膜过滤。

30 （三）山梨糖醇的检测 山梨糖醇的甜度与蔗糖相近。易溶于水，稳定性高，不易与氨基酸、蛋白质等发生褐变反应。我国和FAO/WHO 对ADI 值均未作特殊规定。我国允许在冷饮类、糕点、浓果汁、饼干、面包、酱菜类和糖果中按正常生产需要使用

31 1．原理 用水或乙醇溶液从样品中提取山梨糖醇，用减压浓缩方法将水分全部除去后，制备乙酰化山梨糖醇，用乙醚萃取乙酰化山梨糖醇，浓缩至干，用丙酮定容后进行气相色谱分析。以保留时间定性、峰高或峰面积定量。

32 2. 乙酰化山梨糖醇衍生物的制备 准确吸取样品溶液和山梨糖醇标准溶液各10mL，放入50mL 浓缩器中，准确加入5mL 4mg/mL 木糖醇作为内标液，在60℃水浴上减压浓缩，除去水分，然后加入14mL 无水吡啶和7mL 无水乙醇，在60～70℃水浴上激烈振摇，使残渣溶解，放置过夜。加水20mL 后，用10mL 水定量转移到分液漏斗中，用50mL、30mL、30mL 乙醚分3 次萃取，合并全部乙醚层，用20mL 0．1mol/LH2SO4 洗2 次，再用20mL 水洗1 次，乙醚层加入无水硫酸钠，放置1h。将此液过滤，残渣用50mL 乙醚分数次洗涤，将滤液和洗液合并于圆底烧瓶中，减压浓缩除去乙醚，向残渣中加丙酮使其溶解，准确加至10mL。

33 3.色谱条件 检测器：氢焰电离检测器； 色谱柱：玻璃柱，内径为3mm，长度为2m；内装涂以XE-60（3%）的60～80 目硅烷化处理过的硅藻土担体； 温度：柱温从150℃到220℃以6℃/min 速度升温；检测器为250℃； 载气：氮气，40mL/min。

34 §3 几种常用防腐剂的检测 一、慨述 防腐剂是能防止水平腐败、变质、抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的一类物质的总称。虽然有些防腐剂被认为是比较安全的，但长期或大量使用不行，应尽量少用甚至不用。 防腐剂还在烟草、化妆品、牙膏、药品中应用。

35 防腐剂的品种： 苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、EDTA二钠、 亚硝酸钠、丙酸及其盐、乳酸链球菌素、 新开发的：果胶分解产物、香辛料提取物、 琼脂低聚糖、甜菜碱、日扁柏醇、 类黑精、葡萄糖氧化酶、熏液、 富马酸二甲酯、溶菌酶、鱼精蛋 白等。 禁用的防腐剂：水杨酸、甲醛、硼酸、β-奈酚、 焦碳酸二乙酯等。

36 一、苯甲酸(钠)和山梨酸(钾)的检测 苯甲酸又名安息香酸。为白色有丝光的鳞片或针状结晶，微溶于水， 使用不便，实际生产多用其钠盐。
苯甲酸钠易溶于水和乙醇，难溶于有机溶剂，与酸作用生成苯甲酸。 苯甲酸及其钠盐主要用于酸性食品的防腐，在pH 2.5—4其抑菌作用较强，当pH＞5.5时，抑茵效果明显减弱。对霉菌和酵母菌效果甚差。 COOH COONa

37 山梨酸又名花揪酸，(CH3CH=CHCH=CHCOOH）
苯甲酸进入人体后，大部分与甘氨酸结合形成无害的马尿酸，其余部分与葡萄糖醛酸结合生成苯甲酸葡萄糖醛酸甙从尿中排出，不在人体积累。苯甲酸的毒性较小。 山梨酸又名花揪酸，(CH3CH=CHCH=CHCOOH） 己二烯—（2，4）—酸 为无色、无嗅的针状结晶，难溶于水。 山梨酸钾易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成山梨酸。比苯甲酸更安全，在体内最后成CO2和水。

38 苯甲酸(钠)和山梨酸(钾)的测定方法： （GB/T 5009.29—2003）
气相色谱法——氢焰检测器，两种同时测。 1．原理 样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，用带氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。测出苯甲酸、山梨酸量后，再分别乘以适当的相对分子质量比，求出苯甲酸钠，山梨酸钾量。

39 式中： x──样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m1──测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，μg； m2──样品的质量，g； V1──加入丙酮的体积，mL； V2──测定时进样的体积，mL。

40 2.色谱条件 检测器：氢火焰离子化检测器； 色谱柱：内径3mm，长2m 玻璃柱，内装涂以5%（m/m）DEGS +1%（m/m）H3PO4 固定液的60～80 目Chromosorb WAW。 流速：载气为氮气，50mL/min 温度：进样口230℃，检测器230℃，柱温170℃。

41 3 说明与讨论 （1）本法为国家标准方法，可同时测定食品中苯甲酸和山梨酸的含量，山梨酸保留时间为173 秒，苯甲酸保留时间为368 秒。如图12-2 所示。适用于酱油、果汁、果酱。最低检出限为1ug，用于色谱分析的样品为1g 时，最低检出浓度为1mg/kg。 （2）样品溶液的制备：称取一定量事先混合均匀的样品，置于25mL 带塞量筒中，加0．5mL 盐酸（1︰1）酸化，用15mL、10mL 乙醚提取2 次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一个25mL 带塞量筒中。合并乙醚提取液。用3mL 氯化钠酸性溶液（40g/L）洗涤2 次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL 容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL 乙醚提取液于10mL 带塞刻度试管中，置40℃水浴上挥干，加入2mL 丙酮溶解残渣，备用。

42 （3）通过无水硫酸钠层过滤后的乙醚提取液应达到去除水分的目的，否则乙醚提取液在40℃挥去乙醚后如仍残留水分会影响测定结果。这时必须将残留水分挥干，但会吸出极少量白色氯化钠，当出现此情况时，应搅动残留的无机盐后加入石油醚-乙醚（3︰1）振摇，取上清液进样，否则氯化钠覆盖苯甲酸和山梨酸。

43 高效液相色谱法——同时测这两种及糖精钠。
1.原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH 至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。按下式计算： 式中： m1──进样体积中苯甲酸的质量，mg； m2──样品质量，g； V1──样品稀释总体积，mL； V2──进样体积，mL。

44 4.说明与讨论 （1）本法为国家标准分析方法，可同时测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，适用于酱油、果汁、果酱。山梨酸灵敏波长为254nm，在此波长测苯甲酸和糖精钠的灵敏度较低，苯甲酸和糖精钠的灵敏波长为254nm，为照顾三种被测组分灵敏度，方法采用230nm。 （2）含二氧化碳的样品需经加热除去，含酒精的样品加氢氧化钠溶液调至碱性，于沸水浴中加热以除去酒精。 （3）被测溶液pH 对测定和色谱住使用寿命均有影响，pH>8 或pH <2 时，影响被测组分的保留时间，对仪器有腐蚀作用。苯甲酸和山梨酸的测定以中性为宜。

45 （4）测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，也可以用Micro PAK CN-10 4×300mm 柱，流动相可用甲醇-水。

46 2.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为230nm，灵敏度为0．2AUFS； 色谱柱：YWG－C18 4．6×150mm5μm，或其他型号C18 柱； 流动相：甲醇+乙醇铵溶液（0．02mol/L）（5+95）； 流速：1．0mL/min； 进样量：10μL。

47 薄层色谱法。 1 原理 样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后， 根据薄层板上苯甲酸，山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。计算公式如下： 式中 x―样品中苯甲酸或山梨酸的含量,g/kg； m1―测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，mg；m2―样品质量，g； V1―加入乙醇的体积，mL； V2―测定时点样的体积，m L； 10―测定时吸取液乙醚提取液的休积，mL； 25―样品乙醚提取总体积,m L。

48 2.说明与讨论 （1）本法为国家标准分析方法，可同时测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，适用于酱油、果汁、 果酱。本方法灵敏度高，但操作繁琐，重现性差。 （2）样品中如含有CO2、酒精时应先加热除去，富含脂肪和蛋白质的样品应除去脂肪和蛋白质，以防用 乙醚提取时发生乳化，除去的方法同食品中糖精钠的测定。 （3）样品处理时，酸化的目的是使苯甲酸钠、山梨酸钠转变为苯甲酸或山梨酸，便于乙醚提取。 （4）其它说明与讨论见薄层色谱法测定食品中糖精钠的含量。

49 紫外分光光度法测苯甲酸。 1．原理 样品中苯甲酸在酸性溶液中可以随水蒸气蒸馏出来，与样品中非挥发性成分分离，然后用重铬酸钾溶液和硫酸溶液进行激烈氧化，使除苯甲酸以外的其它有机物氧化分解，将此氧化后的溶液再次蒸馏，用碱液吸收苯甲酸，第二次所得的蒸馏液中基本不含除苯甲酸以外的其它杂质。根据苯甲酸钠在225nm 有最大吸收，故测定吸光度可计算出苯甲酸含量。计算公式如下：

50 2.说明与讨论 （1）样品处理方法为：称取均匀的样品10．0g，置于250mL 蒸馏瓶中，加磷酸1mL，无水硫酸钠20g，水70mL，玻璃珠3 粒进行蒸馏。用预先加有5mL0．1mol／L 氢氧化钠的50mL 容量瓶接收馏出液，当蒸馏液收集到45mL 时，停止蒸馏，用少量水洗涤冷凝器，最后用水稀释到刻度。吸取蒸馏液25mL，置于另一个250mL 蒸馏瓶中，加入1/30mo1／L 重铬酸钾溶液25mL，2mol／L 硫酸溶液6．5mL，连接冷凝装置，水浴上加热10 分钟，冷却，取下蒸馏瓶，加入磷酸lmL，无水硫酸钠20g，水40mL，玻璃珠3 粒，按上述方法进行第二次蒸馏，收集馏出液，最后用水稀释到刻度。 （2）根据样品中苯甲酸含量，取第二次蒸馏液5～20mL，用0．01mol／L 氢氧化钠定容，以0．01mol/L氢氧化钠作为对照液，于225nm 处测定吸收度。 （3）用5mL1mol/L 氢氧化钠代替1mL 磷酸进行第一次蒸馏，按上述样品处理方法作空白试验，测定空白溶液的吸光度。

51 滴定法测苯甲酸 （适于样品中苯甲酸 含 0.1 %以上）
苯甲酸 微溶于水，用乙醚从样品中提取，蒸去乙醚，以标准NaOH滴定。 若样品中是苯甲酸钠，先让其与酸作用成苯甲酸，再按上法测定。

52 二、其他防腐剂的检测 （一）食品中对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的检测
对羟基苯甲酸乙酯又名尼泊金乙酯及尼泊金丙酯。对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯均为苯甲酸的衍生物，分别由对羟基苯甲酸与乙醇和丙醇以硫酸为触媒酯化而成。都是结晶性粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦，灼麻。在水中难溶，但易溶于丙酮、乙醇。因其是酯类，不易受pH 的影响。在pH4~8内防腐效果很好。 摄食后在胃肠中能迅速完全吸收，并水解成对羟基苯甲酸而从尿中排出，不在体内蓄积。其毒性低于苯甲酸，而高于山梨酸。FAO／WHO 联合食品添加剂专家委员会于1994 年规定对羟基苯甲酸乙酯与丙酯的ADI 值均为0~10mg/kg 体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》GB 2760~1996 规定对羟基苯甲酸乙酯与丙酯可使用于果蔬保鲜，最大使用量（以对羟基苯甲酸计）为12g//kg；食醋0．10g/kg；碳酸饮料、蛋黄馅0．20g/kg；果汁饮料、果酱（不包括罐头）、酱油等为0．25g/kg；糕点馅为0．5g/kg。

53 1．原理 样品中的对羟基苯甲酸酯类，用乙腈提取后，经过滤后进液相色谱仪进行测定，与标准比较定性、定量。对羟基苯甲酸甲酯、丙酯保留时间为4．2min、7．6min。计算公式如下： 式中： c──样品溶液的浓度，μg/mL； m──样品质量，g； 25──样品溶液的体积，mL。

54 3.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为254nm；灵敏度为0．16AUFS； 色谱柱：U-Bondapak C18 30cm×4．6mm（内径）； 流动相：乙腈+水（45+55）； 流速：1．5m/min。

55 （二）食品中脱氢醋酸的检测 脱氢醋酸及其钠盐属于广谱防腐剂，特别对霉菌和酵母的抑制能力强，为苯甲酸钠的2~10 倍。该类防腐剂能迅速而完全地被人体组织所吸收，进入人体后即分散于血浆和许多器官中，可抑制体内多种氧化酶的活性。日本1973 年曾报道，该类防腐剂有导致肾结石等问题，因此其安全性受到怀疑。目前日本已经限制使用该类防腐剂。欧共体也禁止使用。我国年生产能力约200 吨，主要用于饲料。但有时也用于袋 装酱菜防腐，且防腐作用很强，用0．02％浓度约60 天无霉变。脱氢乙酸的ADI 值未作规定。

56 1．原理 样品中脱氢乙酸加热溶解后，离心分离，经过滤后直接进液相色谱仪中分离测定，与标准品比较定量。 2．样品溶液的制备 称取人造奶油1g，放入带塞刻度离心管中，加水40mL，加温使试样溶解，强烈振摇，加水50mL，混匀，在离心机上约3000r/min，离心5min，取一部分水层用滤纸过滤，取滤液40mL，用滤膜（0．45μm）过滤，供色谱测定用。

57 3.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为225nm，0．02AUFS； 色谱柱： 4．8mm×50mm，粒径5μm，Unisil Q C18 柱； 流动相：0．03mol/L 乙酸钠乙酸缓冲液+甲醇溶液（7+3）； 流速：0．8mL/min。 本方法脱氢乙酸 的检出限为1.0mg/kg，平均回收率为97.4%，相对标准差为1.66%

58 2 样品溶液的制备 称取约20g 的样品，打碎，准确称取2g 样品于15mL 具塞离心管中，加入5mL 乙腈，塞上塞子，振摇30s 后，于500r/min 离心5min，将上清液转至25mL 容量瓶中，重复操作3 次，用乙腈稀释至刻度。用1．0μm 滤膜过滤，供色谱测定。

59 §4 发色剂的检测 1. 又名护色剂或呈色剂，是能够使肉与肉制品呈现良好色泽的物质。 常用的有亚硝酸盐、硝酸盐。

60 亚硝酸盐和硝酸盐 亚硝基(NO) +肌红蛋白 亚硝基肌红蛋白(MbNO) 巯基(一SH) 亚硝基血色原（ ）
2. 作用机理： 亚硝酸盐和硝酸盐 亚硝基(NO) +肌红蛋白 亚硝基肌红蛋白(MbNO) 巯基(一SH) 亚硝基血色原（ ） 从而赋予食品鲜艳的红色。同时，亚硝酸盐对抑制微生物的增殖有一定作用，与食盐并用可增加抑菌，对肉毒梭状芽孢杆菌有特殊抑制作用。 3. 硝酸盐 固体加热放出氧 亚硝酸盐 分解 退热后放出 鲜红色的

61 4. 亚硝酸盐和硝酸盐作为食品添加剂，过多地使用对人体产生毒害作用。亚硝酸盐与仲胺反应生成具有致癌作用的亚硝胺。
5. 亚硝酸盐对氰化物中毒者是最好的解毒剂。

62 一、亚硝酸盐的检测 （GB/T 5009.33—2003） 《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》 (一) 格里斯试剂比色法 1. 原理
样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为 538 nm，可测定吸光度并与标准比较，定量。

63 2.说明与讨论 （1）本方法为国家标准方法（GB/T5009.33-1996），适用于食品中亚硝酸盐的测定，最低检出限为1mg/kg。
（2）本实验用水应为重蒸馏水，以减少误差。 （3）样品处理方法为：称取约10．00g（粮食取5g）经绞碎混匀样品，置于绞肉机中，加70mL 水和12mL 氢氧化钠溶液（20g/L），混匀，用氢氧化钠溶液（20g/L）将样品的pH 值调至8，定量转移至200mL 容量瓶中加入10mL 硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5mL 氢氧化钠，混匀，置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀，放置0．5h，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集滤液备用。同时作试剂空白试验。

64 （4）此法用于油脂多的样品时，可通过冷却使脂肪凝固后再把它滤去，或用撇去法分开萃取液上层脂肪；
对有色的样品，如红烧的肉类，因其色素影响比色测定，应在硫酸锌沉淀蛋白质后，取其滤液60 mL 于 100mL 容量瓶中，加氢氧化铝乳液定容，然后过滤取其无色透明滤液进行比色测定。若一次加氢氧化铝乳 脱色效果不好，可进行二次，甚至三次加氢氧化铝乳脱色，直至萃取液为无色透明滤液再进行比色测定。 （5）N-1-萘基乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。

65 (二)示波极谱法 1．原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。计算公式如下： 式中x——样品中亚硝酸盐的含量，g／kg m1——测定用样液中亚硝酸盐的质量，ug; V3——样品溶液的总体积，mL; V4——测定用样液的体积，mL; m2 一一样品质量，g

66 2．说明与讨论 （1）8-羟基喹啉溶液配制方法为： 称取0．250 g 8-羟基喹啉，加4mL0．1mol／LHCl 和少量水溶解，移至250mL 容量瓶稀释至刻度。 (2)样品处理方法为：称取5．00 g 经绞碎混匀的样品(午餐肉，火腿肠可称10．00～20.00g)，置于50mL 烧杯中，加12．5mL 硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃的水300mL 将样品洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加入5mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水定溶，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，清液用滤 纸过滤，弃去初滤液50mL，滤液备用。

67 (3)显色过程应严格控制条件。方法为：吸取一定体积的亚硝酸钠标准溶液、样品处理液和试剂空白液，分别置于10mL 容量瓶(或比色管)中。于各容量瓶(或比色管)中分别加入0.20mL 0．10mol／LEDTA 溶液， 1．50mL 8g／L 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静止3～4min 后各加入1．00mLlg／L8-羟基喹啉溶液和0．5mL5％氨水，用水稀释至刻度，混匀，静止10～15min。 （4）在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定，以滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极。测定参考条件为：原点电位调节在—0．2V；倍率为0．1； 电极开关拨至三电极、导数档；测量开关拨至阴极。然后将三电极插入电解池中，每隔7s 仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录— 0．5V 左右的极谱波高。本法为GB/T 中的第二法，相对偏差≤10％。

68 (三)荧光法 亚硝酸盐与过量的对氨基苯磺酸起重氮化反应，剩余的对氨基苯磺酸与荧光胺作用，生成稳定的荧光团和无荧光的水解产物。在激发波长为436nm，荧光波长为495nm 下，其荧光强度与对氨基苯磺酸的量成正比。对氨基苯磺酸的原始量减去重氮化后过剩的对氨基苯磺酸的量，即为与亚硝酸盐发生重氮化反应的对氨基苯磺酸的量，进而可计算出亚硝酸盐的含量。 本法不受检液本身的颜色或混浊干扰，也不受样品稀释度的影响。但操作较为复杂。

69 二、硝酸盐的检测 (一) 镉柱法 1. 原理 样品经沉淀蛋白质、去除脂肪后，得到提取液，将提取液通过镉柱，在pH9.6～9.7的氨缓冲液中，使其中的硝酸根还原为亚硝酸根，然后利用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的总量，由总量减去还原前亚硝酸盐含量即为由硝酸盐还原产生的亚硝酸盐含量。再乘以换算系数，即得硝酸盐含量。 在镉柱中，镉定量地将 NO3-还原成NO 2-

70 镉柱经使用后用稀盐酸除去表面的氧化镉可重新使用 CdO十2HCl CdCl2十H2O 在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1 萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。计算公式如下： 式中： m──样品的质量，g； m1──经镉粉还原后测得亚硝酸钠的质量，μg ； m2──直接测得亚硝酸盐的质量，μg； v1──样品处理液总体积，mL； v2──测定用样液体积，mL。 1．232──亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数

71 2.镉柱 （1）海绵状镉粉的制备：将500mL 硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒经3~4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾斜法多次洗涤，然后移入粉碎机中，加500mL 水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20~40 目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存，备用。

72 （2）镉柱的制备：如图12-3。取25mL 酸式滴定管数支，向柱底压入1cm 高玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新配制的镉粉带水加入柱内，边装边轻轻敲击柱，排除柱内空气，加镉粉至8~10cm 高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。当镉柱填装好后，先用25mL/L HCl 洗涤，再以水洗两次，每次25mL，调节柱流速至3~5mL/min。镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。

73 (3)镉柱还原效率的测定：先加25mL 氯化铵缓冲液于柱中，至液面接近海绵镉时，吸取2．0mL 硝酸钠标准溶液（10μg/mL），经镉柱还原，控制流速3~5mL/min，用50mL 容量瓶接收。加入5mL 氯化铵缓 冲溶液，液面接近海绵镉时，加入15mL 水洗柱，还原液与洗液一并流入50mL 容量瓶中。加5mL60%乙酸，10mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀暗处放置25min。用1cm 比色杯，以标准零管调节零点，于波长550nm 处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率（如镉柱还原率小于95%，应经盐酸浸泡活化处理）。 式中： m──20μg 硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，μg； 20──硝酸盐的质量，μg； 1．232──亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。

74 3.说明与讨论 （1）本方法为国家标准方法（GB/T ），适用于食品中硝酸盐的测定，最低检出限为1.4mg/kg。 （2）在制取海绵状镉和装填镉柱时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化。镉柱每次使用完毕后，应先以25mL0．1mol/L HCl 洗涤，再以水洗2 次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。 （3）为保证硝酸盐测定结果准确，镉柱还原效率应当经常检查。镉柱维护得当，使用一年效能尚无显著变化。

75 （4）在沉淀蛋白质时，硫酸锌溶液的用量不宜过多。否则，在经镉柱还原时，由于加5m L pH9．6～9．7氯化铵缓冲液而生成Zn(OH)2 白色沉淀，堵塞镉柱，影响测定。
（5）镉是有害的元素之一，再制作海绵状镉或处理镉柱时，其废弃液中含有大量的镉，不要将这些有害的镉放入下水道污染水源和农田，要经过处理之后再放入下水道。另外，不要用手直接接触镉，同时不要弄到皮肤上，一旦接触，立即用水冲洗。 （6）其它说明同亚硝酸盐的检测。

76 （二）离子选择性电极法 在0．1mol／L 硫酸钾介质中，用硫酸银除去氯离子干扰，硝酸根离子浓度在10—2～8×10—5 mol／L之间，电位值和硝酸根浓度负对数呈直线关系，由此求出样品溶液中硝酸盐含量。测定时取切碎混匀样品10．0～20．0g，用0.1mol／L 硫酸钾溶液磨匀后，移入100mL 容量瓶中，用0.1mol／L 硫酸钾溶液定容，过滤。取滤液40mL 置另—小烧杯中，插入电极，在搅拌下读取稳定电位，由标准曲线求出硝酸根含量。 此法亚硝酸盐含量占硝酸盐含量的30％～40％时，不影响硝酸盐的测定，如超过这个比例，可加入一定量硝酸盐标准溶液，以提高硝酸盐水平。溶液有颜色或混浊不影响测定。

77 （三）GC法 1.原理 用硫酸在低于95℃时，硝酸根可与苯作用生成硝基苯。然后用气相色谱法分析该生成物，以2-氯萘为内标物，给出一定的峰值和保留时间，据此可推算出样液中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。

78 2.说明与讨论 （1）该方法优点是避免了使用致癌物质萘胺类的化合物，有色物质也不影响测定，可测10mg/kg 以下的硝基苯，回收率达95～99％。 （2）严格控制硝酸根与苯的反应。可采用下面的方法：按上面镉柱法处理样品，取30mL 样品处理液和20mL 苯于分液漏斗中，充分振摇后，静置，分层，分出水层，收集于100mL 三角瓶中，加10mL 苯。 滴加50mL80%的硫酸，滴加速度以苯刚刚沸腾或将要沸腾为宜，令反应5min。然后将全部混合物移入分液漏斗中，用碳酸钠和水洗苯层，收集苯层。 （3）本方法还可用高锰酸钾将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，测定亚硝酸盐含量。

79 §5 漂白剂——二氧化硫及亚硫酸盐的测定 漂白剂是为使食品保持特有的色泽、退色或不褐变。依靠漂白剂的氧化或还原能力，破坏食品的变色因子。
§5 漂白剂——二氧化硫及亚硫酸盐的测定 漂白剂是为使食品保持特有的色泽、退色或不褐变。依靠漂白剂的氧化或还原能力，破坏食品的变色因子。 1. 食品中的漂白剂本身无营养价值。 2. 严格控制使用量，因为对人体健康有一定影响。 3. 要求对食品的品质、营养价值及保存期不应有不良影响。 《食品中亚硫酸盐的测定》GB/T

80 一、盐酸副玫瑰苯胺比色法(国标中第一法）
二氧化硫及亚硫酸盐的测定方法有多种。 一、盐酸副玫瑰苯胺比色法(国标中第一法） (一)原理 亚硫酸盐或二氧化硫，与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质，其色泽深浅与亚硫酸含量成正比，可比色测定。反应式如下： α—羟基磺酸

81 副玫瑰苯胺 盐酸副玫瑰苯胺 黄色

82 Α—羟基磺酸

83 于波长550nm 处有最大吸收峰，且在一定范围内其色泽深浅与亚硫酸盐含量成正比，故可比较定量。
计算公式如下： 式中： V──测定用样液的体重体积，mL； m1──测定用样液中二氧化硫的含量，μg； m──样品质量，g。

84 （二) 说明： ① 颜色较深样品，需用活性炭脱色。
① 颜色较深样品，需用活性炭脱色。 ② 样品中加入四氯汞钠吸收液以后，溶液中的二氧化硫含量在24小时之内稳定，测定需在24小时内进行。 （四氯汞钠作为萃取剂，如果用水萃取，易造成SO2的丢失，20℃时，1体积水溶解40体积SO2）。

85 ③ 此方法适用于含SO2 ＜ 50 ppm,含量高时适于用碘量法及中和法测定。
④ 四氯汞钠毒性甚大，有人研究用EDTA代替。 二、蒸馏滴定法 (一)原理 在密闭容器中对样品进行酸化并加热蒸馏，蒸出二氧化硫，然后用乙酸铅溶液吸收，用浓盐酸酸化，再用碘标准溶液滴定。

86 三、离子色谱法 (一）原理 样品中的亚硫酸盐在弱酸性条件下加热溢出，用pH6的水承接，然后以淀粉作指示剂，用碘标准溶液滴定至终点，根据碘标准溶液消耗量计算出样品中二氧化硫的含量。 SO2 +I2 + 2H2O H2SO4 + 2HI

87 （二）说明与讨论 1. 本方法适用于食品中残留亚硫酸盐和天然亚硫酸盐的测定。亚硫酸在0．01～4．0ug／100uL 范围内呈线性关系，最小检出量为0．2ug／g。在红葡萄酒、糖豆、蜜饯樱桃、豆酱、冷冻虾、玉米粉等样品中，添加二氧化硫至10ug／g、100ug／g，依次测定回收率为89％～109．0％。对1ug／mL 二氧化硫标准溶液测定10 次，相对标准偏差为0．44％。 mgCl－、SO42—、NO3—、甲酸、乙酸、乙醇，10mg 甲醛、糖醛、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、 甲硫醇钠、丙烯基异硫氰酸盐及0．1mgS2—对测定无干扰。NO2—、乙醛、苯甲醛有严重负干扰，二氧化氮干扰可用氨基磺酸铵消除，醛类干扰用2，4-DNP 消除。

88 §6 食用合成色素的检测 为了弥补食品中本来特有的色泽在加工、储藏中的损失， 使其尽可能恢复至原来的颜色，除采取一定护色措施外，往往还得添加一定量的食用色素，进行着色。 这些靓丽的色泽能促进人的食欲，给人以美感，增加消化液的分泌。 在各种花色蛋糕、冰棒、糖果、果脯、饮料、色酒、果酱、罐头中都有色素。

89 食用色素就来源可分为天然色素及人工合成色素两大类。
天然色素——是从一些动、植物组织中提取的，目前我国开发有80余种。如：红曲米粉、辣椒红、辣椒黄、姜黄、叶绿素铜钠盐、虫胶、番茄红素、红花黄、焦糖色、胡萝卜素、黄酮类色素等。 优点： 其安全性相对高，有的有营养价值，个别有毒如：藤黄剧毒！ 缺点： 稳定性差，着色能力差，难以调出任意的色泽，且资源较短缺，目前还不能满足食品工业的需要；

90 合成色素是用有机物合成的，主要来源于煤焦油及其副产品，资源十分丰富。合成色素具有稳定性好、色泽鲜艳、附着力强、能调出任意色泽等优点，因而得到广泛应用，但由于其具有一定的毒性，使用范围及用量须加以限制。
合成色素如：笕菜红、胭脂红、赤藓红、桔黄、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝等。

91 目前，在食品行业中使用单元色素已较少，需使用复合色素方可达到较满意的色泽，因而给其分析测定带来了一定困难。
《食品中合成着色剂的测定》GB/T 薄层层析法 （一）原理 在酸性条件下，用聚酰胺吸附水溶性合成色素，而与天然色素，蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离。然后在碱性条件下，用适当的溶液将其解吸，再用薄层层析法进行分离鉴别，与标准比较定性、定量。

92 高效液相色谱法 （一）原理 合成色素在酸性条件下用聚酰胺粉吸附或用液-液分配提取，然后制成样液（水溶液），注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，以保留时间和峰面积进行定性和定量。

93 第十一章重点 食品添加剂的定义。 食品添加剂的分类。 NaNO2、苯甲酸钠、SO2的测定。