实验七 肠道杆菌 练习内客 一、常见肠道杆菌的革兰氏染色镜检。

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1 实验七 肠道杆菌 练习内客 一、常见肠道杆菌的革兰氏染色镜检。
实验七 肠道杆菌 练习内客 一、常见肠道杆菌的革兰氏染色镜检。 二、常见肠道杆菌在选择或鉴别培养基上的菌落特点，主要生化反应及动力观察和 绿脓杆菌、变形杆菌培养特性的观察。 三、肥达氏反应

2 目的要求 1．掌握肠道条件致病菌与肠道致病菌的菌落特点。 2．掌握肠道杆菌的主要生化反应。 3．熟悉肥达氏反应的原理，操作方法及结果判读。 4．初步了解肠道杆菌的分离鉴定方法。

3 肠道菌科的细菌为革兰氏阴性杆菌，大多数有鞭毛，能运动。少数无鞭毛不能运 动，不产生芽胞，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐（欧文氏菌属例外）。

4 这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。有 的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。
鉴别肠道杆菌一般用生化反应作初步鉴定，然后再根据各种菌的抗原特异性作进一 步的鉴定（包括血清学试验和特异性噬菌体的溶菌试验）。

5 一、肠道杆菌的形态及染色特性 肠道杆菌都是革兰氏阴性，两端钝圆的杆菌，无芽胞，多数有鞭毛（用一般染色法 不能见到），故肠道杆菌的染色镜检只能初步判断，不能做为肠道杆菌之间的鉴别依似。

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9 练习一 常见肠道杆菌的革兰氏染色镜检 【材料】
练习一 常见肠道杆菌的革兰氏染色镜检 【材料】 大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌的18—24小时琼脂斜面培养物。生理盐水、接种环、载玻片、酒精灯、革兰氏染色液、蜡笔等。

10 【方法】 1．取载玻片，用蜡笔分成4格，于每格放2—3接种环生理盐水。 2．用接种环分别取大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌和变形杆菌制成涂片，注意无菌操作。 3．革兰氏染色后镜检，记录结果

11 二、常见肠道杆菌的菌落特点，生化反应及动力
肠道杆菌营养要求不高，在普通培养基上能生长，大多形成中等大小，表面光滑形态相似的菌落，因而也不能做为鉴别的依据。但它们生化反应活泼，对糖和蛋白质可产生不同的代谢产物，可借生化反应鉴别各种肠道菌，特别是肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多数分解乳糖，临床上常用比特性分离肠道致病菌。

12 用于分离培养肠道病原菌的选择或鉴别培养基很多，下面介绍常用的二种：
S—S琼脂平板和中国蓝平板的主要成份及用途。

13 SS（salmonella—Shigella平板） 中国篮平板（CB）
基质 牛肉汤基础培养基 抑制物 胆盐、煌绿、构橼酸钠、硫代硫酸钠 蔷薇酸 底物 乳糖 指示剂 中性红 硷→黄色 硷→红 酸→红色 中国篮 pH（6.8—8.0） 酸→黄 ＋为红色菌落 ＋为蓝色菌落 菌落持点 乳糖发酵 —为无色半透明菌落 抑制作用 抑制大肠杆菌及G＋菌 抑制G＋菌 用途 鉴别肠道的致病菌与非致病菌

14 在选择或鉴别培养基上，大肠杆菌因分解乳糖产酸可使指示剂变色而形成较大，不透明的有色菌落，而致病菌不分解乳糖（24小时内）而形成较小，半透明的无色菌落。 大多数肠道杆菌（包括致病菌和非致病菌）都能分解葡萄糖，但有的产酸，有的产酸又产气，可对分离的细菌作初步鉴定，常用的培养基为双糖培养基，它的基本成份如下： （图7一1）

15 如果在双糖管斜面层培养基内，加有硫酸亚铁，即为双糖铁培养基，可同时观察产 生H2S情况。
如做进一步鉴定需进行一系列的生化反应试验，如葡、乳、麦、甘、蔗五管糖发酵 试验，IMViC试验，硫化氢产生试验，尿素分解试验及血清学诊断等。

16 常见肠道杆菌在选择或鉴别培养基上的菌落特征，主要生化反应，动力观察及 绿脓杆菌，变形杆菌，肺炎杆菌的菌落特点

17 【材料】 1．大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌在中国蓝培养基， S—S琼脂的18—24小时培 养物。 2．菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、痢疾杆菌的五管糖及双糖铁培 养基的18—24小时培养物。 3．变形杆菌、绿脓杆菌及肺炎杆菌在普通琼脂平板的24小时培养物。 【方法】 观察各种细菌在不同培养基中的生长特点及生化反应情况，分别将结果填入实验报 告。

18 三、伤寒、副伤寒病的血清学诊断 机体被伤寒杆菌或副伤寒杆菌感染后，经过一定的时间，血清中开始出现特异性抗 体，并与相应细菌发生凝集。
机体被伤寒杆菌或副伤寒杆菌感染后，经过一定的时间，血清中开始出现特异性抗 体，并与相应细菌发生凝集。 其中抗伤寒杆菌“O”抗原的抗体属1gM型，它具有出现早、消退快（指体内无抗原刺激时，总体水平下降快）的特点，又与甲、乙两型副伤寒杆菌有交叉反应，故可作为伤寒杆菌，副甲、副乙近期感染的一个观察指标。

19 在特异性抗体中，抗“H”抗原的抗体，对于伤寒杆菌和甲、乙两型副伤寒杆菌的 特异性较高，无交叉反应，只凝集相应的抗原，据此可区别这三种肠热症病原菌引起的 感染。
根据以上原理，可用已知的伤寒杆菌“O”菌液（用乙醇处理保存O抗原）和已知 的伤寒杆菌，副伤寒甲、乙的“H”菌液（用甲醛液处理保存H抗原）作抗原。分别与病人血清作定量凝集反应以测定特异性抗体的含量及增长情况，辅助诊断伤寒和副伤寒 病。这种方法由法国内科医师肥达（Widal）氏最先建立的，故称为肥达氏反应.

20 练习三 肥达氏（Widal）氏反应 【原理】用标准伤寒、副伤寒菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判定待测 血清中有无抗伤寒或抗副伤寒杆菌的抗体，与传统肥达氏反应不同，此试验在微量反应 板上操作。

21 【材料】 诊断伤寒“H”抗原，诊断用伤寒“O”抗原，诊断副伤寒甲“H”（PA）抗原，诊断用副伤寒乙“H”（PB）抗原，疑为伤寒，副伤寒患者的血清（1）号、（2）号、生理盐水、大试管、小试管、10毫升吸管、 1毫升吸管。

22 【试剂】 取伤寒O、H和副伤寒甲、乙、丙诊断菌液（70亿菌／毫升），分别用生理盐水稀释成10亿菌／毫升，为便于观察，每10毫升稀释菌液中加入石炭酸复红（抗酸染色用染液）10ul，或加20.0g／L美蓝溶液50ul。

23 【方法】 1．取小试管24支，分四行排列试管架上每行6支，用蜡笔在每行第一支试管上记 以H、O、A、B标记。 2．取大试管1支，用10毫升吸管加入生理盐水3.8毫升，再用1毫升吸管吸取待检病人血清0.2毫升，反复吹吸三次使其混合（此时血清稀释度为1∶20）。 3．用吸管吸取1∶20稀释血清2毫升，于每行第l管中各加0.5毫升。 4．再在大试管中加生理盐水2毫升，混匀（此时稀释度为l∶40）吸取2毫升分别加入每行第2管中各0.5毫升。

24 5．按上述方法继续操作至每行第五管，此时第3—5管内的血清稀释度为1︰80、 1︰160、1︰320。 6．于每行第6管各加生理盐水0
5．按上述方法继续操作至每行第五管，此时第3—5管内的血清稀释度为1︰80、 1︰160、1︰320。 6．于每行第6管各加生理盐水0.5毫升作对照。 7．另取4支吸管，分别吸取H、O、A、B四种菌液分别加入第1、2、3、4排的每一试管中，每管0.5毫升，即第1排各管加H抗原，第二排各管加O抗原，第3排各管加A抗原，第4排各管加B抗原，这时每行第l一6管的稀释度分别为1︰40、l︰80、1︰160、1︰320、1︰640。

25 8．振荡试管架，使之混匀置37℃过夜，次日观察结果。
【结果判断】 阳性结果表现为液体澄清，有红色或蓝色细颗粒，均匀平摊于整个孔底，阴性表现 为蓝或红色菌体集中一点，沉积于孔底，与菌液对照相同，以出现50％（++）凝集的血 清最高稀释倍数的倒数为待检血清滴度。

26 【参考值】 与传统肥达氏反应相同，即O凝集价>80，H凝集价>160才有诊断价值，如双份血清效价有4倍以上增长更有意义。

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29 思考题 1．假设大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌混杂在肉汤培养基中，你怎样把它们分离出来，使各自成为纯培养物
思考题 1．假设大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌混杂在肉汤培养基中，你怎样把它们分离出来，使各自成为纯培养物? 2．在Widal氏反应中再加一排副伤寒丙菌“H”液，能否同时诊断副伤寒丙菌感染?为们么?