菌（毒）种选育及保存技术.

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1 菌（毒）种选育及保存技术

2 主要内容 一、菌种、毒种的概念与分类 二、菌种、毒种的一般要求 三、菌种、毒种的选育

3 一、生物制品菌种和毒种的概念与分类 (一)概念 凡应用于生物制品既疫苗、类毒素、免疫血清及诊断制剂等的生产、鉴定和研究的所有细菌种、病毒种以及分类地位上在原虫以下的生物种都属于生物制品的菌、毒种范围。 菌（毒）种是国家的重要生物资源，现在世界各国对这项资源都极为重视，并设置各种专业性的保藏机构，现在不少国家的菌种与毒种中心都用电子计算机进行管理，在欧洲甚主准备对国家问的菌种中心用电子计算机联网。

4 分类 1．生产用的菌、毒种 直接生产用的菌、毒种，免疫用的菌、毒种和加工用的菌毒种三种。 2．工具菌种 如生产噬菌体的痢疾杆菌等。
3．鉴定用菌毒种 如安全试验、效力检验用的菌毒种，保护力试验攻毒用的强毒菌毒种，因子血清效价及特异性测定的菌种。 4．标准菌株或参考菌株

5 二、生物制品菌种和毒种的一般要求 （一）来源（历史）清楚，资料完整 ：
菌种和毒种是生物制品质量的关键因素之一。制备疫苗必须安全、有效；诊断制剂必须特异而敏感。 （一）来源（历史）清楚，资料完整 ： 由专门机关保管、分发的生物制品用菌种和毒种，对其来源、分离和传代的历史、生物学特性以及免疫学特性、安全与效力检定等资料，有关审批单位的鉴定，结论及审核批示材料均应清楚。 人用菌、毒种的管理由中国药品生物制品检定所负责。兽医生物制品生产所需的菌种和毒种，由中监所或中监所委托分管的单位负责供应。 我国兽医生物制品菌种和毒种管理3种情况：①中监所鉴定和保管；②委托有关单位代管，如委托哈尔滨兽医研究所管理的猪丹毒GC42菌苗株、黑龙江省生物制品一厂代管的禽霍乱G190E140菌苗株等；③各地菌种，由中监所统一鉴定，如大肠杆菌。

6 （二）生物学特性比较典型： 生物学特性包括菌种和毒的形态特征，培养特性(菌落特征、蚀斑特征)，对动物的病原性特点及引起细胞病变的特征，生物化学、免疫学及血清学特性等等，均应符合标准。 制造灭活苗的菌种和毒株，应该是标准强毒或者某些弱毒，以免疫原性优良为基本条件，必须经过严格的审查与鉴定，要求一切性状必须典型。如《规程》规定，制造丹毒灭活苗，必须选择典型光滑型、圆形、露珠状的小菌落。 制造弱毒苗的毒种与菌种，毒力必须稳定，形态特征典型，不易变异，特别应注意其与强毒株生物学性状区别的要点。对制备活疫苗的菌种和毒种，必须严格筛选、严格检验。特别应注意其安全性，包括菌种和毒种本身及外源性污染两个方面。

7 （三）血清型相符： 在菌种和毒种选择与鉴定时，需特别注意菌种和毒种特性与血清型与疫苗使用地区流行的病原相符。

8 （四）遗传性状稳定： 菌种和毒种在保存、传代和使用过程中，受各种因素影响而变异，因此保证其遗传性状稳定是保证生物制品质量的重要因素之一。微生物种是以群体形式存在，遗传学纯一性和相对稳定性是指群体变异幅度必须有严格的限制。为保持种的纯一和相对稳定，生产生物制品的菌、毒种应通过定期传代、筛选、检定等工作进行控制。 生产用的病毒毒种是否具有同质性，直接关系到生物制品的质量。我国用于生产畜禽用活疫苗的病毒毒种，一类是我国自行分离培育的弱毒株；另一类是从国外引进的。二者大部分都未进行过纯化和标准化，均属于群体（多克隆）病毒，病毒粒于的大小与构造、增殖速度、蚀斑形成能力。

9 （五）毒力在规定范围内：视情况而定 灭活苗 弱毒苗 效力检验的毒株

10 三、菌种的鉴定方法与标准 毒力鉴定 抗原性鉴定 稳定性试验
用于制造菌苗的各菌种，应按各自的制造方法制成菌苗。免疫试验动物，设对照组，用强毒攻击，看保护率。 稳定性试验 传代培养，观察其生物学特性，测定以上指标，证明稳定

11 五、菌（毒）种的保存方法 有条件放在液氮罐中于-196℃以下保存，效果更为理想。
为了保持菌种和毒种的特性（包括毒力及免疫原性）的稳定，不发生变化，最好采用冷冻真空干燥方法保存。 有些毒种可用含毒组织在低温条件下（-15℃）以下冻结保存。 有条件放在液氮罐中于-196℃以下保存，效果更为理想。

12 六、菌种和毒种选育 (一)强毒力菌种和毒种选育
强毒菌种和毒种广泛用于诊断制品、抗病血清、灭活疫苗和疫苗制品的效力检验。用作人工培育弱毒的原始毒种，并用于微生物学、免疫学及传染病学等研究。 强毒菌种和毒种常自疾病流行地区的典型患病动物体内分离。在疾病流行初期，从临床症状和病理变化典型而又未经任何治疗的患病动物体分离到毒力强和抗原性良好的自然强菌株和毒株，如我国的石门系猪瘟病毒和多杀性巴氏杆菌C44-1等。然后，用从各地分离的自然强菌株和毒株中筛选出符合标准的菌株和毒株，供生物制品的制造和检验。

13 筛选出毒力强，生长稳定、纯净的毒株，用于制备疫苗、诊断液和治疗用抗体活用于疫苗效力检验等
(一)强毒力菌种和毒种选育 病毒或细菌分离 鸡胚 冻干、冷冻或冷藏保存 筛选出毒力强，生长稳定、纯净的毒株，用于制备疫苗、诊断液和治疗用抗体活用于疫苗效力检验等 稳定性试验 抗原性试验 致病力试验 纯粹性试验 原动物 抗原性 细胞 LD50 ELD50 免疫原性 实验 动物 EID50 攻毒保护 试验 血清学 TICD50

14 1．毒力鉴定 常用易感实验动物、本动物、鸡胚或易感细胞测定分离菌株和毒株MLD(最小致死量)、LD50(半数致死量)、CELD50(鸡胚半数致死量)、CEID50(鸡胚半数感染量)或TCID50(细胞半数感染量) 2．免疫原性测定 菌株和毒株的抗原性包括：抗原与抗体结合发生特异性反应的反应原性和刺激机体产生抗体及致敏淋巴细胞的免疫原性。反应原性多采用血清学方法测定，以抗体滴度或效价表示；免疫原性多采用对免疫动物用定量原强毒菌株和毒株攻击测定保护效力。无论致病力测定或抗原测定，均应设阴阳性对照，否则无效。

15 3．稳定性测定 对适应于培养基、鸡胚或易感细胞上增值培养和传代的菌株或毒株的毒力（致病力）和抗原性还要进行稳定性测定，以证明其后代特性不变，才有使用价值，并参与筛选择优。 4．综合判定，冻干保存 根据致病力、抗原性和稳定性测定结果，筛选出毒力强、形状稳定的菌株或毒株，经增值后进行冻干保存。冻干后菌种于4C°保存，冻干的病毒种保存于-20°以下，可保存多年。通常经鉴定的菌株或毒种批，按需分装后冻干保存，可使用多年。冻干菌株或毒种一经动物传代，即应重新分离、鉴定和检测后方能供种子或种毒用。

16 (二)弱毒菌种和毒种的选育 1. 弱毒菌种和毒种 弱毒菌种和毒种主要用于弱毒活疫苗、部分诊断制品以及抗血清的制造。
弱毒菌株和毒株的重要特征是致病力极微弱或无致病力，免疫原性优良，能使免疫动物获得坚强的免疫力。 从自然界筛选，或以人工改变野生型强毒株的遗传特性进行培育获得。无论自然弱毒株或人工培育弱毒株，均是由微生物基因核苷酸碱基的改变，而导致遗传性状突变及毒力降低的结果。

17 2.弱毒菌种和毒种的选育途径 弱毒菌（毒）种的选育 化学途径 人工诱变致弱 同源动物(如NDV LaSota株) 自然弱毒株的分离
异源动物(如HVT FC126株) 物理途径 生物途径 亚硝基胍 醋酸铊 洗衣粉 高温 紫外线 非易感动物 鸡胚、细胞 杂交减毒

18 1.自然弱毒株的选育 自然弱毒株又称自发突变毒株，由自然强毒株在自然因素作用下因遗传基因突变形成了与祖代性状(特别是致病力和抗原性)不尽相同的生物株。这些自然因素，如异种非易感动物、温度、日光、干燥、紫外线等都可能是导致细菌和病毒自发突变的原因。因此，人们往往有意或无意地从自然中分离、筛选和育成一些弱毒菌 (毒)株，作为兽医生物制品的种毒。 例如，鸡新城疫出LaSota弱毒株，是分别从自然鸡群和鸭群中分离到的，然后再通过克隆、挑选等途径育成。然而，微生物自发突变率往往很低，形成具有稳定遗传性状的过程比较长，因此获得的机率不高。

19 2.经典方法诱发突变弱毒株的选育 (1)通过化学途径选
微生物在体外培养传代过程中，经诱变剂处理，可极大地提高其基因突变率，从而获得弱毒菌株或毒株。 亚硝基胍是一种烷化剂，具有强大的诱变作用，微量即引起微生物突变，诱变率达1%，主要干扰DNA的复制。 实例：通过亚硝酸基胍处理支原体育成了鸡支原体疫苗株和肺炎支原体突变株；猪副伤寒沙门氏菌强毒株则在含有1/500～1/4000醋酸铊的肉汤培养基中培养传代50代次，可培育成弱毒株，用于制造疫苗。

20 (2)通过物理途径选育 热和干燥等物理因素可干扰DNA的复制，从而引起突变，导致遗传性状的改变。
1881年巴斯德将炭疽强毒菌株在42.5℃高温下长期传代培养，导致了遗传性状变异，从而育成了炭疽弱毒菌株作为制造用菌种； 卡介苗是由法国巴斯德研究所的卡默特和介林（Calmette & Guerin）于1908年对一株从乳牛脓液分离的毒力很强的牛型结核菌进行了研究，发现该菌在胆汁马铃薯培养基上经过30次传代后，已不能使牛犊发病，到1920年经过230代的传代后，通过动物试验反复证明该菌株不但已经不能使任何动物物致病，且能产生获得性免疫力。1921年证明该菌苗至少对人类确实安全有效。 日本乙型脑炎病毒强毒株则经紫外线照射后引起突变，从而出现遗传性状分离，再进行蚀斑挑选，育成了弱毒株。

21 (3)通过生物途径选育 通过生物途径育成的弱毒株，其生物稳定性极佳，但育成过程比较长。迄今，大部分活疫苗的菌种和毒种是由该途径选育而成。常用育成路线有: A 适应非易感动物 (非自然宿主) 通常用兔、小鼠、地鼠、豚鼠、鸡等实验动物进行，其优点是动物来源广、饲养管理方便、成本低及操作简便。多采取大剂量腹腔、静脉或脑内接种。如我国的猪瘟兔化弱毒株，是将猪瘟病毒强毒株通过兔体传400余代后育成的。 B 适应细胞 通常多采用同源或异源动物组织的原代细胞，或者是一种细胞，或者用2种细胞。我国的马传染性贫血驴白细胞弱毒株，是将马传贫驴强毒株通过驴白细胞传代育成的。

22 将两种遗传性状不同的菌株或毒株，在传代培育中进行自然杂交，以导致不同菌株或毒株间基因发生交换而育成有使用价值的弱毒株。
C 杂交减毒 将两种遗传性状不同的菌株或毒株，在传代培育中进行自然杂交，以导致不同菌株或毒株间基因发生交换而育成有使用价值的弱毒株。 如:流行性感冒弱毒株的育成，是将温度敏感弱毒株(抗原性较低)与流行强毒株进行混合培养传代，便两者毒力基因发生交换，其后代即成为毒力低和抗原性强的毒株，再用于制造弱毒疫苗。

23 复习思考题 1．菌（毒）种选育的基本原则是什么？ 2．简述弱菌（毒）种主要特征? 3．兽用生物制品菌（毒）种标准有哪些？

24 THE END