上饶师范学院 生物化学实验 主讲: 林弘 张勇 上饶师范学院生命科学系 生物科学实验教学中心.

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1 上饶师范学院 生物化学实验 主讲: 林弘 张勇 上饶师范学院生命科学系 生物科学实验教学中心

2 目 录 1.生物化学实验室规则 2.生物化学实验基本操作 3.实验一 3,5——二硝基水杨酸比色定糖法
上饶师范学院 目 录 1.生物化学实验室规则 2.生物化学实验基本操作 3.实验一 3,5——二硝基水杨酸比色定糖法 4.实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 5.实验三 总氮量的测定——微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法 生物科学实验教学中心

3 6.实验四 脂肪碘值的测定 7.实验五 维生素C的定量测定 8.实验六 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 9.实验七 组织DNA的提取纯化
上饶师范学院 6.实验四 脂肪碘值的测定 7.实验五 维生素C的定量测定 8.实验六 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 9.实验七 组织DNA的提取纯化 10.实验八 酪蛋白的制备 生物科学实验教学中心

4 生物化学实验室规则 （2课时） 1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。
上饶师范学院 生物化学实验室规则 （2课时） 1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查签字同意，方可离开实验实。 生物科学实验教学中心

5 上饶师范学院 4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。 5使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅自动手检修。 生物科学实验教学中心

6 6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！
上饶师范学院 6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！ 7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。 8 仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 生物科学实验教学中心

7 9 实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。
上饶师范学院 9 实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。 10每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工作。 生物科学实验教学中心

8 生物化学实验基本操作 （2课时） 一. 玻璃仪器的洗涤
上饶师范学院 生物化学实验基本操作 （2课时） 一. 玻璃仪器的洗涤 在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。 ㈠ 常用的洗涤方法： 1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。 生物科学实验教学中心

9 （2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。
上饶师范学院 2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上； （2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。 生物科学实验教学中心

10 3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法： （1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；
上饶师范学院 3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法： （1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗； （2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗； （3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。 生物科学实验教学中心

11 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。
上饶师范学院 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。 5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。 生物科学实验教学中心

12 ㈡ 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点： 1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。
上饶师范学院 ㈡ 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点： 1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。 2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。 3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。 生物科学实验教学中心

13 4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。
上饶师范学院 4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。 5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。 生物科学实验教学中心

14 上饶师范学院 重铬酸钾洗液的配制: 取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。注意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。 生物科学实验教学中心

15 吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。 ㈠ 吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。
上饶师范学院 二. 吸量管的使用 吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。 ㈠ 吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。 1.刻度吸量管： ⑴刻度吸量管的种类： 生物科学实验教学中心

16 上饶师范学院 ①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。 生物科学实验教学中心

17 上饶师范学院 ②按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大)。两种标示方法，在使用时各有方便之处。 ③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻到尖端的。 生物科学实验教学中心

18 上饶师范学院 ⑵刻度吸量管的正确使用方法： 用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。 生物科学实验教学中心

19 ①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。
上饶师范学院 ⑶使用刻度吸量管的注意事项： ①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。 ②仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？ ③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。 生物科学实验教学中心

20 ⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。
上饶师范学院 ④吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。 ⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。 生物科学实验教学中心

21 ⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。
上饶师范学院 ⑥吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。 ⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。 生物科学实验教学中心

22 3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。
上饶师范学院 2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。 3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。 生物科学实验教学中心

23 ㈡ 定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。
上饶师范学院 ㈡ 定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。 1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。 生物科学实验教学中心

24 上饶师范学院 2.定量吸液器的类型：有两种类型。 ⑴固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。 生物科学实验教学中心

25 一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。
上饶师范学院 ⑵可调式：在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。例如规格为50～200μl的可调式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等）。 一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。 生物科学实验教学中心

26 ⑴选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。
上饶师范学院 3.定量吸液器的使用方法： ⑴选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。 ⑵持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。 ⑶取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。 生物科学实验教学中心

27 ⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。
上饶师范学院 ⑷排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。 ⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。 生物科学实验教学中心

28 ⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；
上饶师范学院 三. 溶液的混匀 ㈠混匀的目的： ⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应； ⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。 生物科学实验教学中心

29 ⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。
上饶师范学院 ㈡ 混匀的方法通常有以下几种： ⒈使盛器作离心运动。 ⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。 ⒊利用旋涡混合（振荡）器混匀。 ⒋不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。 生物科学实验教学中心

30 上饶师范学院 ㈢ 混匀的注意事项： ⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。 ⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。 生物科学实验教学中心

31 上饶师范学院 四. 离心机的使用 离心法是分离沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。 生物科学实验教学中心

32 1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。
上饶师范学院 电动离心机的使用方法： 1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。 2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。 生物科学实验教学中心

33 上饶师范学院 3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。 生物科学实验教学中心

34 实验一 3,5—二硝基水杨酸比色定糖法 （8课时） 目的和要求 1.掌握3,5—二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
上饶师范学院 实验一 3,5—二硝基水杨酸比色定糖法 （8课时） 目的和要求 1.掌握3,5—二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。 2.用3,5—二硝基水杨酸定糖法测定样品中的总糖及还原糖。 生物科学实验教学中心

35 上饶师范学院 实验原理 3,5----二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。 该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。 生物科学实验教学中心

36 取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：
上饶师范学院 实验步骤 一、葡萄糖标准曲线的绘制 取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂： 生物科学实验教学中心

37 上饶师范学院 将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。 生物科学实验教学中心

38 上饶师范学院 二、样品中总糖和还原糖含量的测定 1.样品中还原糖的提取：准确称取2g样品，放入100ml烧杯内，加入85％乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温　30min，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水定容，备用。 生物科学实验教学中心

39 上饶师范学院 2.样品中总糖的水解及提取：准确称取样品1g，放入大试管中，加入1ml 6mol/L盐酸和15ml蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾－碘溶液检查水解程度，若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞指示剂1滴。以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，定容，备用。 生物科学实验教学中心

40 3.样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别按下表加入各种试剂：
上饶师范学院 3.样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别按下表加入各种试剂： 生物科学实验教学中心

41 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。
上饶师范学院 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。 生物科学实验教学中心

42 思考题 1.比色测定的操作要点是什么？方法的基本原理是什么？ 2.72型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？
上饶师范学院 思考题 1.比色测定的操作要点是什么？方法的基本原理是什么？ 2.72型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？ 3.比色测定时为什么要设计空白管？ 4.总糖包括哪些化合物？ 生物科学实验教学中心

43 实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （6课时）
上饶师范学院 实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （6课时） 目的和要求 1.掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。 2.定量测定血清中各种蛋白质的相对百分含量。 生物科学实验教学中心

44 上饶师范学院 实验原理 采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120μm。 生物科学实验教学中心

45 上饶师范学院 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜电泳趋向于代替纸电泳。 生物科学实验教学中心

46 上饶师范学院 实验步骤 一、仪器和薄膜的准备 1.醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。 生物科学实验教学中心

47 上饶师范学院 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。 2.制作“滤纸桥”：剪裁尽寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电泳槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 生物科学实验教学中心

48 上饶师范学院 3.平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电泳槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡15～20min。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。 生物科学实验教学中心

49 上饶师范学院 二、点样 在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端1.5㎝处。点样时，先用血色素吸管将2～3微升的血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内（见下图）。注意。应使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 生物科学实验教学中心

50 上饶师范学院 生物科学实验教学中心

51 上饶师范学院 三、电泳 将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，参照下图。平衡10min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后,通电。打开电源开头，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3mA，通电10～15min后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10V左右，薄膜每厘米宽的电流强度为0.4～0.6mA。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5㎝时，则并闭电源，一般通电时间为60min左右。 生物科学实验教学中心

52 上饶师范学院 生物科学实验教学中心

53 上饶师范学院 四、染色 电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 生物科学实验教学中心

54 一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
上饶师范学院 五、结果判断 一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。 生物科学实验教学中心

55 上饶师范学院 六、透明 将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1min（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约2～3min内的薄膜完全透明，放置10～15min后，用吹风机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约３min后取出。再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。 生物科学实验教学中心

56 未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。
上饶师范学院 七、定量 未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。 生物科学实验教学中心

57 上饶师范学院 １．洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸入盛有0.4mol/L氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入4ml，其余每管各加２ml，摇匀，放入37℃恒温水浴上浸提30min，每隔10min，充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24小时内颜色强度无显著变化。然后在620nm波长处比色，测定各管的光密度值为O.DA、O.Dα1、O.Dα２、O.Dβ、O.Dγ。按下列方法计算血清各部分蛋白质所占百分率。 生物科学实验教学中心

58 上饶师范学院 （１）先计算光密度值总和（简写为Ｔ）： 生物科学实验教学中心

59 （２）再计算血清各部分蛋白质所占百分率（即相对百分含量）：
上饶师范学院 （２）再计算血清各部分蛋白质所占百分率（即相对百分含量）： 生物科学实验教学中心

60 正常值： 清蛋白54.0～73.0； α１球蛋白2.8～5.1% ； α2球蛋白6.3～0.6%； β球蛋白5.2～1.0%；
上饶师范学院 正常值： 清蛋白54.0～73.0； α１球蛋白2.8～5.1% ； α2球蛋白6.3～0.6%； β球蛋白5.2～1.0%； γ球蛋白12.5～0.0%。 生物科学实验教学中心

61 上饶师范学院 ２．光密度计法：将干燥的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪（或色谱扫描仪）内，通过反射（使用未透明的薄膜时）或透射（用已透明的薄膜时）方式，在记录器上自动绘出血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种蛋白质组分。然后，用求积仪测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的重量，计算每个峰的重量与它们总重量的查分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。 生物科学实验教学中心

62 上饶师范学院 思考题 指出醋酸纤维素薄膜用作电泳的支持物有何优点？ 生物科学实验教学中心

63 上饶师范学院 备注 ①染色液、漂洗液和透明液应在密封的瓶子内贮存。否则，易挥发的成分蒸发，使溶液各组分配比发生改变，影响实验结果。在气侯温度较高的季节，更要十分注意，特别是透明液。 ②电泳时间的长短，应以获得血清各组分的最佳分离效果为标准。因为，使用不同型号电泳仪进行实验，有时所需电泳时间差异较大。另外，电泳时产生大量的热，为了获得重复性强、区带清晰的电泳图谱，应使用冷却装置降温。在炎热的夏季，更为必要。 生物科学实验教学中心

64 实验三 总氮量的测定——微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法 （8课时）
上饶师范学院 实验三 总氮量的测定——微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法 （8课时） 目的和要求 1.学习微量凯氏定氮法的原理。 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。 生物科学实验教学中心

65 实验原理 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。
上饶师范学院 实验原理 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 生物科学实验教学中心

66 上饶师范学院 消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。 以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下： 生物科学实验教学中心

67 本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应小于±2%。
上饶师范学院 测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。 本法适用的范围为 mg氮。相对误差应小于±2%。 生物科学实验教学中心

68 上饶师范学院 实验步骤 一、样品处理 血清样品：取人血或猪血（蛋白质样品含水量一般为10%～12%），放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去血凝块，上层黄色透明清液，即为血清。吸出1ml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。溶液如显浑浊，加少量氯化钠，再混匀。 生物科学实验教学中心

69 上饶师范学院 固体样品：测定某一固体样品中的含氮量，是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示（%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。 生物科学实验教学中心

70 上饶师范学院 二、消 化 准备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入2ml稀释血清溶液（或4ml核酸制品溶液，或200mg固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入2ml水，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。 生物科学实验教学中心

71 上饶师范学院 在每个烧瓶中加入约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用量筒加入化学纯浓硫酸3ml，将以上4个烧瓶放到消化架上（见图4-1），（如无消化架，可将烧瓶放在置于通风橱内或通风处的电炉上）进行消化。接好抽气装置，调节煤气量。先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重地影响样品的测定结果。 生物科学实验教学中心

72 上饶师范学院 当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到使瓶内液体微微沸腾。假如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液体将它冲洗下来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的状况下大约维持6～8小时（对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要12小时）。 生物科学实验教学中心

73 上饶师范学院 待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30%过氧化氢溶液1～2滴，加到瓶底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告完成（固体样品约需7小时）。为了保证反应的彻底完成，再继续加热消化1小时。消化完结，关闭煤气灯，使烧瓶冷却室温。 生物科学实验教学中心

74 上饶师范学院 三、蒸馏 1.仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。一般洗涤是先用水洗净棒状玻塞（见下图）周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品加入时立即放氨。 生物科学实验教学中心

75 上饶师范学院 使用前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪器），加样前使蒸汽通过1～2min即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸-指示剂混合液中指示剂颜色合格为止，洗涤方法如下： 生物科学实验教学中心

76 上饶师范学院 取2～3个50ml的维形瓶，加入5ml左右2%硼酸-指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器（见上图），器中盛有用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，并加几滴甲基红指示剂蒸馏器中还应放入一些毛细管，它们的长度必须超过液面，也可以用一些玻璃珠或小段橡皮管，它们都有防止爆沸的作用，关闭夹子9，使蒸汽通过反应室7中的插管10，进入反应室，再由冷凝器11的下端逸出。 生物科学实验教学中心

77 上饶师范学院 在冷凝器下端放一只空烧杯以承受凝集的水滴。这样用蒸汽洗涤5min左右后，在冷凝器下口放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶12，位置如上图，冷凝器下端应完全浸没于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min。观察锥形瓶中溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部洗涤干净。 生物科学实验教学中心

78 上饶师范学院 实际上因指示剂极为灵敏，很难达到完全不变色。含有指示剂的硼酸溶液，紫褐色，即使不接收氨蒸汽，只放在室内的桌面上，几分钟后，也可能会因吸收了空气中的CO2而变色，因此，在操作过程中应保证硼酸溶液不被其它试剂反污染（这点很重要）。 生物科学实验教学中心

79 上饶师范学院 洗涤较长时间未使用的仪器，用硼酸-指示剂混合液于冷凝管下品接收蒸汽时，若1～2min后溶液未变成鲜绿色，而只变成灰色或暗绿色，即可认为是基本上未变色，仪器已洗净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1，继续通蒸汽1min，最后用水冲洗冷凝管外口，移开火焰，打开夹子，可准备样品测定。 生物科学实验教学中心

80 上饶师范学院 2.样品及空白蒸馏：加样前先撤火1（熟练后此步可省去，不撤），并务必打开夹子9（这是本实验关键之一，否则，样品会被倒抽到反应器外）。取下棒状玻塞6，用吸管吸取2ml消化液，细心地插到反应器小玻杯的棒状玻玻6的下方。这步必须切实做到，以免加碱后氨立即挥发逸走，让反应液流入反应室7中，塞上棒状玻塞，取1只盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必须在硼酸注面之下（这是本实验关键的一步）。 生物科学实验教学中心

81 上饶师范学院 此锥形瓶在加碱液（30%氢氧化钠溶液）前或者也可以加样品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保证全部吸收氢氧钠溶液与样品接触时放出的氨。用量筒向小玻杯5加入10ml 30%氢氨化钠，加完后，轻轻地旋转着向上提起棒状玻塞（小玻杯5极易损坏，提放玻塞时就小心操作），使碱液慢慢流入反应室7，在碱液尚未守全流入时，将玻塞盖紧，向小玻杯5中加入约5ml蒸馏水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在玻杯中水封。 生物科学实验教学中心

82 上饶师范学院 蒸馏：用煤气灯1加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子9，开始蒸馏。锥形瓶中硼酸-指示剂混合液吸收氨，由紫色变为绿色，自变色起记时，蒸馏3～5min。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1，并用少量蒸蒸馏水洗涤冷凝管下口外面，继续蒸馏1min。拿开锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。按以上操作再蒸馏二次后，三瓶一起滴定，再进行消化空白液的蒸馏。 生物科学实验教学中心

83 上饶师范学院 排废液及洗涤：一次蒸馏结束后，为了排出反应后的废液，在小玻杯中倒入冷蒸馏水，并加大煤气灯火焰。待蒸汽很足，反应室外壳7温度很高（烫手，这时反应室下方的夹子9是紧闭的），反应室中液体沸腾，连续不断冒泡后，于右手轻提捧状玻塞，使冷水流入反应室的同时，立即左手用劲捏橡皮管4，这时因反应室外壳8中的蒸汽比反应室7中的多，遇冷收缩较大，压力应力降低较多，结果，反应室7废液通过的反应室中的插管10自动地被抽到反应室外壳中。 生物科学实验教学中心

84 上饶师范学院 塞住玻塞，取蒸馏水约20ml，加入小玻杯，提起玻塞，冷水再流入反应室，又自动抽出，如此反复几次即可排尽应废液及洗涤废液。若外壳中已有较多的废液，可待反应室外壳蒸热后，右手捏夹子9，放出一些废液，左手立即捏一下橡皮管4，积存液即从反应室中排出，这样左右手交替几次，也可排出反应室内的液体。如此冲洗3～4次。打开夹子9，排出反应室外壳中积存的废液，关闭夹子9，再用蒸汽通过会套蒸馏仪数分钟后，继续下一次蒸馏。 生物科学实验教学中心

85 “样品”及“标准”，因含氨极多，硼酸应用液吸收大量氨蒸汽后，颜色发生明星突变，由暗绿突然地变为鲜绿色。“空白”因含氨极少，无明显的颜色突变。
上饶师范学院 “样品”及“标准”，因含氨极多，硼酸应用液吸收大量氨蒸汽后，颜色发生明星突变，由暗绿突然地变为鲜绿色。“空白”因含氨极少，无明显的颜色突变。 生物科学实验教学中心

86 3.滴定：全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。
上饶师范学院 3.滴定：全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。 生物科学实验教学中心

87 若测定的样品含氮部分是蛋白质（如血清），则：
上饶师范学院 四、计算 若测定的样品含氮部分是蛋白质（如血清），则： 式中：A为滴定样品用去盐酸平均毫升数：B为滴定空白用去盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数；0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为系数（1ml0.01N盐酸相当于0.14mg氮）。 生物科学实验教学中心

88 上饶师范学院 若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测验定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白质⑤，再进一步折算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮-非蛋白氮 蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25 生物科学实验教学中心

89 思考题 1.指出下列试剂的作用： （1）消化含氮样品时使用的浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜粉末。
上饶师范学院 思考题 1.指出下列试剂的作用： （1）消化含氮样品时使用的浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜粉末。 （2）蒸馏滴定中的30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液及2%硼酸溶液中的指示剂。 2.指出本测定方法产生误差的原因。 3.正式测定未知样品前为什么必须测定标准硫酸铵的含氮量及空白？ 4.写出以下各步的化学反应式： （1）蛋白质消化 （2）氨的蒸馏 （3）氨的滴定 生物科学实验教学中心

90 备注 ①蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影响实验结果的准确度。
上饶师范学院 备注 ①蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影响实验结果的准确度。 ②若反应室内液体太多，超过1/2，又不易排出时，只能拆开仪器倒出贮液。但是一般尽量避免发生此种情况。折卸时应特别小心，防止损坏仪器。拆卸仪器应首先放松用来固定冷凝管的万能夹，然后小心地将冷凝管向下错开，待反应室外壳与冷凝管分开后，再移动反应室。 生物科学实验教学中心

91 上饶师范学院 ③“空白”滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氨。因些，水质对“空白”滴定值的影响甚大。“消化样品”最后用“消化空白”进行校正计算，“不消化的样品”最后用“不消化的空白”进行校正计算。而且，在实验中，稀释样品的水与“空白”的水应当取自于同一瓶中。 生物科学实验教学中心

92 ⑤最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。但操作麻烦一些。
上饶师范学院 ④蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白南都有恒定的含氮量，一般大约为14-18%，平均为16%。由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25（即每含氮1g，就表示该物质含蛋白质6.25g）即为蛋白质量。 ⑤最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。但操作麻烦一些。 生物科学实验教学中心

93 实验四 脂肪碘值的测定 （4课时） 目的和要求 1.学习脂肪碘值测定的原理和方法。 2.了解测定脂肪碘值的意义。 上饶师范学院
实验四 脂肪碘值的测定 （4课时） 目的和要求 1.学习脂肪碘值测定的原理和方法。 2.了解测定脂肪碘值的意义。 生物科学实验教学中心

94 加成反应：─CH═CH─ + IBr─→ C2H2IBr 释放碘： IBr+KI ─→ KBr + I2
上饶师范学院 实验原理 脂肪中，不饱和脂肪酸链上有不饱和键，可与卤素(Cl2, Br2, I2 )进行加成反应，不饱和键数目越多，加成的卤素量就越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每100g脂肪所吸收的碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。本实验使用溴化碘(IBr)进行碘值测定。IBr的一部分与不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。具体反应过程如下： 加成反应：─CH═CH─ + IBr─→ C2H2IBr 释放碘： IBr+KI ─→ KBr + I2 滴定： I2+2Na2SO4 ─→2NaI +Na2S4O6 生物科学实验教学中心

95 上饶师范学院 实验步骤 准确地称取0.3—0.4g花生油2份，置于两个干燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。加入10ml四氯化碳，轻轻摇动，使油全部溶解。用滴定管仔细地加入25ml溴化碘溶液（Hanus溶液），勿使溶液接触瓶颈。盖好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴10%碘化钾溶液封闭缝隙，以免碘的挥发损失。 生物科学实验教学中心

96 上饶师范学院 在20—30℃暗处放置30min，并不时轻轻摇动。放置30min后，立刻小心地打开玻璃塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失。用新配制的10%碘化钾10ml和蒸馏水50ml把玻璃赛和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混匀。用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。加入1%淀粉溶液约1ml，继续滴定。将近终点使，用力振荡，使碘由四氯化碳层全部进入水溶液内。 生物科学实验教学中心

97 上饶师范学院 再滴定至蓝色消失为止，即达滴定终点。另作2份空白对照，除不加样品外，其余操作同上。滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳。计算碘值按下式计算碘值： 碘值 = （A-B）×T×100/C 式中，A = 滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数， B = 滴定碘化后样品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数， C = 样品的重量(g)， T = 1ml 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数。 生物科学实验教学中心

98 思考题 1.测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值之间有何区别？ 2.加入溴化碘溶液后，为何要在暗处存放30min？
上饶师范学院 思考题 1.测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值之间有何区别？ 2.加入溴化碘溶液后，为何要在暗处存放30min？ 3.滴定过程中，淀粉溶液为何不能过早加入？ 4.滴定完毕放置一些时间后，溶液返回蓝色，否则表示滴定过量，为什么？ 生物科学实验教学中心

99 上饶师范学院 备注 ① 碘瓶必须洗净，干燥，否则瓶中的油中含有水分，引起反应不完全。加入碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变成浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加10—15ml试剂。 ② 如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。 ③ 将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴过头或不足。如振荡不够，CCl4层会出现紫色或红色。此时应当用力振荡，使碘进入水层。 ④ 淀粉溶液不宜加得过早。否则，滴定值偏高。 生物科学实验教学中心

100 实验五 维生素C的定量测定 （4课时） 目的和要求 1.学习定量测定生素C的原理和方法。 2.进一步掌握滴定法的基本操作技术。
上饶师范学院 实验五 维生素C的定量测定 （4课时） 目的和要求 1.学习定量测定生素C的原理和方法。 2.进一步掌握滴定法的基本操作技术。 3.了解蔬菜中维生素C的含量。 生物科学实验教学中心

101 上饶师范学院 实验原理 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。它是具有L系糖构型的不饱和多羟化合物，属于水溶性维生素。维生素C分布很广，植物的绿色部分及许多水果（桔类、草莓、山楂、辣椒等）的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。在碱性溶液中，加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化面破坏。在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将染料2，6－二氯酚靛酚还原成无色的还原型2，6－二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。 生物科学实验教学中心

102 上饶师范学院 生物科学实验教学中心

103 上饶师范学院 氧化型2，6－二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当用2，6–二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6–二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦全部被氧化时，则滴下的2，6–二氯酚靛酚立即呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。此时即为滴定终点。从滴定时2，6–二氯酚靛酚标准的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。 生物科学实验教学中心

104 上饶师范学院 该法简便易行，但有下列缺点：①在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗血酸的形式存在。它们同样具有维生素C的生理作用，但不能将2，6–二氯酚靛酚还原脱色。②生物组织提取物和生物体液中常含有其他还原性物质，其中有些也可以在同样实验条件下使2，6–二氯酚靛酚还原脱色。③在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。 生物科学实验教学中心

105 上饶师范学院 实验步骤 用分析天平准确地称取样品约0.5克。样品必须用温水洗去泥土，并在空气中风干。放入研钵中，加1％盐酸溶液5～10ml一起研磨。放置片刻，将提取液滤入50ml容量瓶。如此反复抽提2～3次。最后用1％盐酸液稀释到刻度并混匀。每次量取5ml放入小锥形瓶内进行滴定。 生物科学实验教学中心

106 要使结果准确，滴下使用的2，6–二氯酚靛酚钠在1～4ml之间，若滴定结果超过此范围，则必须增减样品用量或交提取液适当稀释。
上饶师范学院 用微量滴定管，以0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液（蓝色）滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持15～30秒不褪。滴定过程必须迅速，不要超过2min。因为在本滴定条件下，一些非维生素C还原物质的还原作用较迟缓，快速滴定右以避免或减少它们的影响。 要使结果准确，滴下使用的2，6–二氯酚靛酚钠在1～4ml之间，若滴定结果超过此范围，则必须增减样品用量或交提取液适当稀释。 另取5ml 1％盐酸作空白对照滴定。 生物科学实验教学中心

107 提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算。 计算：
上饶师范学院 提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算。 计算： 式中：VA为滴定样品提取液所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数；VB为滴定空白对照所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升数；C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；W为被检样品的质量。T为1毫升标准0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液相当维生素C的毫克数，T的具体数目为mg/ml。 生物科学实验教学中心

108 上饶师范学院 思考题 指出本实验采用的定量测定维生素C的方法有何优缺点？ 生物科学实验教学中心

109 实验六 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 （6课时）
上饶师范学院 实验六 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 （6课时） 目的和要求 1．学习分光光度计的原理和使用方法。 2．学习测定淀粉酶活力的方法。 3．了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 生物科学实验教学中心

110 实验原理 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
上饶师范学院 实验原理 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n＋H2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计法测定。 生物科学实验教学中心

111 实验步骤 1．种子发芽： 小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2．酶液提取：
上饶师范学院 实验步骤 1．种子发芽： 小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2．酶液提取： 取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂 200毫克，加 1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心（l500转／min）6－7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。取干燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上）。 生物科学实验教学中心

112 （1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。
上饶师范学院 3．酶活力测定： （1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。 生物科学实验教学中心

113 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人10％3,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。
上饶师范学院 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人10％3,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。 （2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。 （3）用空白管作对照；在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填入上表。 生物科学实验教学中心

114 4．计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知 则C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准
上饶师范学院 4．计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知 则C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准 式中C代表浓度；A为光吸收值。 生物科学实验教学中心

115 上饶师范学院 思考题 1．为什么要将各试管中的溶液置于25℃水浴中保温？ 生物科学实验教学中心

116 上饶师范学院 实验七 组织DNA的提取纯化 （8课时） 目的和要求 学习从鼠肝中提取动物DNA的方法。 生物科学实验教学中心

117 上饶师范学院 实验原理 DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。 生物科学实验教学中心

118 上饶师范学院 核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类基因组含2.9×109bp。 生物科学实验教学中心

119 无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。
上饶师范学院 无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。 要从生物组织中提取DNA，DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。 生物科学实验教学中心

120 上饶师范学院 需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm／O.D280nm能达到1.8左右为标准。 生物科学实验教学中心

121 分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有： (1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。
上饶师范学院 分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有： (1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。 生物科学实验教学中心

122 双链DNA含量： O.D260nm×样品稀释倍数×50ug／ml= ug/m1样品。
上饶师范学院 (2)DNA分子很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考： 双链DNA含量： O.D260nm×样品稀释倍数×50ug／ml= ug/m1样品。 生物科学实验教学中心

123 上饶师范学院 实验步骤 1．取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70℃冰箱中保存，用时取出。 生物科学实验教学中心

124 2. 1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次，每次0.5分钟)
上饶师范学院 2. 1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次，每次0.5分钟) 3．取塑料离心管1支加入1／3匀浆液(若匀浆液太稠，则再加入lmlTE缓冲液)，然后再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心10000转／分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。 注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。 生物科学实验教学中心

125 上饶师范学院 4．水相加入一刻度离心管中后，加入2.5倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体积)，加5mol／L NaCl到终浓度为0.1mol／L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。 生物科学实验教学中心

126 5．用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。
上饶师范学院 5．用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。 6．沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用lmlTE缓冲液溶解。 7．在1mlDNA溶液中加入10mg／ml的RNA酶20μl，使最终浓度达到200ug／ml，37℃保温30分钟。 生物科学实验教学中心

127 上饶师范学院 8．加入20％SDS25ul，使最终浓度至0.5％；加入0.5mol/L EDTA30ul至20mmol/L；加10mg／ml蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug／ml，50℃保温30分钟。 9．加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质，至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，离心10000转／分钟×5分钟。 生物科学实验教学中心

128 11. 在一干净的塑料离心管中用0.3—0.5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。
上饶师范学院 10．吸取水相，水相吸至一干净刻度离心管中量出积体，再加入2.5倍体积的冰无水乙醇，加5mol／LNaCl至终浓度为0.1mol／L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤沉淀一次。 11. 在一干净的塑料离心管中用0.3—0.5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。 12．吸取DNA原液100ul，用TE缓冲液稀释至3ml(1:30稀释)，(若DNA原液太浓，取原液50ul，太稀则取原液200u1)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm及O.D280nm的读数。计算：O.D260nm／O.D280nm比值，DNA浓度及DNA总量。 生物科学实验教学中心

129 思考题 1．如样品中有蛋白质存在，其紫外分析结果有何表现?如何进一步纯化?
上饶师范学院 思考题 1．如样品中有蛋白质存在，其紫外分析结果有何表现?如何进一步纯化? 2．DNA的定量可采用那些方法?目前常用的是哪种?如何测定DNA的含量? 3．从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么?应如何控制? 4．能引起DNA变性的因素有哪些?DNA降解和DNA变性有何区别?如何鉴别? 生物科学实验教学中心

130 备注 1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。
上饶师范学院 备注 1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。 (2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。 (3)酚抽提时勿剧烈振摇。 2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。 3.苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。 4.离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。 生物科学实验教学中心

131 上饶师范学院 实验八 酪蛋白的制备 （6课时） 目的和要求 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识，掌握用酸性溶剂使蛋白质的pH值发生变化而利用等电点沉淀法制取蛋白。 生物科学实验教学中心

132 上饶师范学院 实验原理 蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。 生物科学实验教学中心

133 实验步骤 方法一： 1.取牛奶50ml，离心（3000 r/min）15 min，除去脂层。
上饶师范学院 实验步骤 方法一： 1.取牛奶50ml，离心（3000 r/min）15 min，除去脂层。 2.向脱脂奶中加入50ml水后用0.5mol/L HCl调整pH到4.6，离心（2000 r/min） 3min。 3.取沉淀加入100ml水并用0.5mol/L NaOH调整pH到7.0，用0.5mol/L HCl调pH到4.6，离心（2000 r/min）3 min。 生物科学实验教学中心

134 5.取沉淀1 mol/L NaOH调整pH到7.5,溶解后装入透析袋中透析48h，即得酪蛋白粗品。
上饶师范学院 4.重复上述操作一次。 5.取沉淀1 mol/L NaOH调整pH到7.5,溶解后装入透析袋中透析48h，即得酪蛋白粗品。 生物科学实验教学中心

135 2.用水洗沉淀3次，离心10 min(3000 r/min)，弃去上清液。
上饶师范学院 方法二: 1.将50ml牛奶加热到40℃。在搅拌下慢慢加入预热到40℃的pH4.7的醋酸缓冲液50ml。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷至室温。离心15 min(2000 r/min)，弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2.用水洗沉淀3次，离心10 min(3000 r/min)，弃去上清液。 生物科学实验教学中心

136 3.在沉淀中加入30ml乙醇。搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇－乙醚混合液洗沉淀两次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。
上饶师范学院 3.在沉淀中加入30ml乙醇。搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇－乙醚混合液洗沉淀两次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。 4.将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。 5.准确称重，计算含量和得率。 生物科学实验教学中心

137 上饶师范学院 含量：酪蛋白g/100 ml牛乳 式中理论含量为3.5g/100ml牛乳。 生物科学实验教学中心

138 思考题 1.为什么调整溶液的pH值可将酪蛋白沉淀出来？ 2.用有机溶剂沉淀蛋白质的原理是什么？ 3.试述透析法去除酪蛋白中杂质离子的原理。
上饶师范学院 思考题 1.为什么调整溶液的pH值可将酪蛋白沉淀出来？ 2.用有机溶剂沉淀蛋白质的原理是什么？ 3.试述透析法去除酪蛋白中杂质离子的原理。 生物科学实验教学中心