组织学绪论 西北师范大学生命科学学院.

Presentation on theme: "组织学绪论 西北师范大学生命科学学院."— Presentation transcript:

1 组织学绪论 西北师范大学生命科学学院

2 研究内容 组织学（histology） 研究机体微细结构及其相关功能的科学 研究水平：组织、细胞、亚细胞和分子
比较组织学(compare histology) 研究不同动物微细结构及其相关功能的科学 肌动蛋白 肌球蛋白 肌钙蛋白 细肌丝 粗肌丝 肌球蛋白杆 肌球蛋白头

3 组织（tissue） 意义 构成：细胞群和细胞外基质 细胞：机体结构和功能的基本单位，成人约有1015 个、200 余种
细胞外基质：由细胞分泌形成 类型：上皮组织、结缔组织、肌组织和神经组织；组织以不同的种类、数量和方式组合形成器官；若干功能相关的器官构成系统 意义 促进了生理学的进步 是病理学的基础 促进人类对自身的深入了解

4 光学显微镜简称光镜（light microscope，LM）
发展简史 光学显微镜简称光镜（light microscope，LM） 16 世纪末荷兰人发明光镜 1665 年英国人胡克命名“细胞” 意大利人马尔比基观察了脾、肺、肾、表皮 荷兰人列文虎克发现红细胞、精子、肌纤维；格拉夫发现卵泡 1801 年法国人比沙提出“组织”概念

5 细胞学说 德国人施万、施莱登（1838、1839）提出了细胞学说.
内容：细胞是一切动、植物体的基本结构和功能单位；细胞内进行着复杂的化学反应；新细胞由原有细胞产生 由于显微技术的提高、组织切片机的发明、生物标本的固定和染色方法的出现，19世纪下半叶成为组织学和细胞学发展的黄金时代。到19世纪末人们已能较正确地描述细胞结构。

6 电子显微镜简称电镜（electron microscope, EM）
1932 年 德国人卢斯卡和科诺尔发明电镜，使分辨率从0.2μm提高到 0.2nm 约二十年后出现超薄切片术（50~80nm）同时，以观察物体表面结构的扫描电镜问世组织学进入第二个黄金时代。 可观察超微结构（ultrastructure）：即细胞膜、细胞器、染色体等亚细胞结构，组织学从细胞水平飞跃到了亚细胞水平。

7 当代组织学 新仪器、新技术的发明和应用，如图像分析仪、共焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等。
免疫组织化学技术能显示细胞和组织中的蛋白质，提供其定位、定性和定量的信息，可获知亚细胞结构的蛋白组成、空间分布关系及在细胞不同时期的变化。 原位杂交技术能在切片上特异性地显示器DNA与mRNA片断，提供细胞所含基因及其表达的信息。 免疫组织化学技术和原位杂交技术将组织学引入分子水平。 组织工程学技术拓展了组织学的临床应用前景，在体外模拟培养皮肤、软骨、骨等器官和组织。

8 学习方法 审视角度 组织水平：层次顺序、特征性结构和细胞 细胞水平：主要细胞的分布、结构特点（含重要细胞的超微结构）及功能 形态和结构相统一
结构是功能的基础，功能是结构的必然表现 培养观察能力：重视实习课和图像观察 培养空间思维能力：将二维图形还原为三维构像

9 技术简介 光镜技术 石蜡切片术（paraffin sectioning）：取材、固定、脱水、（置换）、包埋、切片（5～10 µm 厚）、贴片、脱蜡、染色 苏木精- 伊红染色法（hematoxylin-eosin staining， HE染色法）：苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，使胞质和细胞外基质着红色 嗜酸性（acidophilia); 嗜碱性(basophilia) 中性（neutrophilia） 特殊染色：

10 用硝酸银将神经细胞染为黑色(镀银染色法)
用醛复红将弹性纤维和肥大细胞的分泌颗粒染为紫色 活体染色，即将无毒或毒性小的染料经静脉注入后，再取材制成切片观察。如注入的台盼蓝(trypan blue)可被肝、脾等器官内的巨噬细胞吞噬 。 在组织化学术,常使用荧光染料染色或作为标记物,用荧光显微镜观察

11 用于观察组织细胞表面结构，具有真实的立体感，无需制备切片
电镜技术 透射电镜术（TEM） 用于观察组织细胞的超微结构，需制备超薄切片（50 ~80nm 厚）并经电子染色，根据电子束在不同结构上被散射程度的差异表现为电子密度高（黑或深灰色）和电子密度低（浅灰色） 扫描电镜术（SEM） 用于观察组织细胞表面结构，具有真实的立体感，无需制备切片

12 透射电镜术：组织块(lmm3)用戊二醛与饿酸两次固定，脱水后树脂包埋，用超薄切片机切片，再经醋酸铀和拧橡酸铅染色。电子束射落到切片时，随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、饿的程度不同，而发生相应的电子散射。当电子束技射到密度大、吸附重金属多的结构(如溶酶体)时，电子被散射得多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，习惯称该结构为高电子密度( electrondensity)；反之呈浅灰色，称低电子密度 扫描电镜术：不需要制备切片，组织块(约0.3cm大小)用戊二醛和饿酸固定后，经脱水、干燥，再于其表面喷镀薄层碳与金属膜。

13 组织化学 组织化学术（histochemistry）为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术，与组织学技术结合而产生的技术，在组织切片显示某种物质的存在和分布状态及定量信息。 分类： 一般组织化学术 免疫组织化学术 原位杂交术

14 脂类：锇酸固定染色，呈黑色[用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色，使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色 ]
一般组织化学术：组织中的某种结构成分与所加试剂发生化学反应并呈现某种颜色，在显微镜下可观察到 糖类： 用PAS（过碘酸希夫）反应显示多糖和糖蛋白，呈紫红色[糖被强氧化剂过腆酸氧化后，形成多醛；后者再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合，形成紫红色反应产物] 脂类：锇酸固定染色，呈黑色[用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色，使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色 ] PAS反应，小肠上皮杯状细胞的粘原颗粒

15 核酸：福尔根反应显示DNA，甲基绿－派若宁反应同时显示DNA与RNA[切片先经稀盐酸处理，使DNA水解；再用希夫试剂处理，形成紫红色反应产物。如要同时显示DNA和RNA，则用甲基绿-派若宁反应。甲基绿与细胞核DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色] 酶类：酶与特异性底物的反应产物、再与捕捉剂反应，形成有色的沉淀物 [将切片置于含特异性底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再和某种捕捉剂结合，形成显微镜下可见的沉淀物，即最终反应物。例如显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物(常用β一甘油磷酸纳)的溶液(pH5.0)中孵育，底物经酶水解，释放磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，此时可在电镜下观察(经超薄切片技术加工后)；如再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到(图11-5 )。由于酶都是蛋白质,故近年更多采用免疫组织化学术显示 ]

16 免疫组织化学（immunohistochemistry） 根据抗原、抗体特异性结合原理，检测组织切片中的肽和蛋白质。
用标记的抗体与组织中的抗原结合，标记物可于显微镜下观察。肽和蛋白质均具有抗原性。当把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物，其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后，与标记物相结合，即成为标记抗体。用后者与组织切片孵育，抗体则与组织中相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。 标记物有荧光素（荧光显微镜观察）、辣根过氧化物酶（光镜或电镜观察）、胶体金(多用于电镜观察) 免疫化学荧光-毛血管内皮 A 胶体金标记 B 辣根过氧化物酶标记

17 原位杂交术（in situ hybridization）
即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（mRNA）。 原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示和检测，而获知待测核酸的有无及相对量。 常用标记物有放射性核素35S、32P、3H和地高辛 免疫组织化学（辣根过氧化物酶-胰岛B

18 放射自显影术（autoradiography）
概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态。 [将放射性核素或放射性核素标记的物质注入体内，间隔一定时间后取材、制备切片，并在其上涂以薄层感光乳胶，置暗处曝光，再显影、定影。这样，在放射性核素或其标记物存在的部位，溴 化银被还原为黑色的微细银粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组织和细胞中的分布及相对含量] 如: ①用3H标记的胸腺嘧啶核苷 研究DNA合成和细胞增殖状态 ②用125I 观察甲状腺滤泡内碘化部位 放射自显影像（3H-TdR掺入） ↓增殖的肝细胞 △非增殖的肝细胞

19 图像分析术（image analysis）又称形态计量术（morphometry）：应用数学和统计学原理对组织切片提供的平面图像进行分析，从而获得立体的组织细胞内有形成分的数量、体积、表面积等参数，从量的角度显示结构与功能的关系 体视学（stereology）：根据连续的组织切片应用计算机进行三维重建，以获得微细结构的立体模型 计算机三维重建 示肝小叶血管

20 细胞培养术（cell culture） 把从机体取得的细胞在体外模拟体内的条件下进行培养；培养组织块或器官则称组织培养术或器官培养术
用于研究细胞、组织的代谢、增殖、分化、形态和功能变化，以及各种理化因子对活细胞的影响。 培养条件：适宜营养、生长因子、pH值、渗透压、O2和CO2浓度、温度，控制污染 用相差显微镜观察 体外培养的平滑肌细胞 （免疫组织化学染色显示肌动蛋白） 体外培养的成纤维细胞在倒置显微镜下的图

21 组织工程（tissue engineering）
用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术 正在构建的有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管、角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功，已成为商品用于治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病 研究包括四个方面： ① 种子细胞，即增殖旺盛的细胞，多为干细胞 ② 细胞外基质，可用生物材料（如牛胶原）和人工合成高分子材料 ③ 构建组织或器官，即把细胞置于细胞外基质中进行三维培养、并形成所需要的形状 ④ 将构建物移植机体的方法

22 本章重点 组织学、组织、嗜酸性、嗜碱性的概念 组织学学习方法要点 石蜡切片术和超薄切片术的基本原理 HE染色法