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蛋 白 质 含 量 的 测 定 —微量凯氏定氮法 王冬亮 讲师 87330724 wdliang@mail.sysu.edu.cn.

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1 蛋 白 质 含 量 的 测 定 —微量凯氏定氮法 王冬亮 讲师

2 蛋白质的理论知识: 蛋白质组成: 必需AA,条件必需AA,非必需AA,限制AA,AA模式 蛋白质来源: 蛋白质功能: 蛋白质的评价:

3 食物蛋白质的营养评价: 一 蛋白质的含量 1.真消化率 二蛋白质消化率 2.表观消化率 1.生物价 2.蛋白质净利用率 三蛋白质利用率
3.蛋白质功效比值 4.氨基酸评分 三蛋白质利用率

4 蛋白质含量的测定方法: 定氮法 双缩尿法(Biuret法) Folin-酚试剂法(Lowry法) 紫外吸收法
考马斯亮蓝法(Bradford法) 红外线检测

5 蛋白质测定方法的比较:

6 微量凯氏定氮法

7 一、实验目的: 1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 和方法。 2、学会使用凯氏定氮仪。

8 二、实验原理: 1. 氮元素: 蛋白质区别于糖和脂肪的特征,
1. 氮元素: 蛋白质区别于糖和脂肪的特征, 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近,一 般恒定在15~17%,平均值为16%左右。 只要测定出生物样品中的含氮量,再乘以相 应的蛋白质换算系数(均值为6.25、乳制品为 6.38),就可以计算出样品中的蛋白质含量。

9 2. 含氮量的测定 反应方程式 再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气 用硼酸吸收氨气 用标准盐酸进行滴定
先高温条件下强酸(浓H2SO4)把 样品中的蛋白质的有机氮全部 消化为无机氮形式 再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气 用硼酸吸收氨气 用标准盐酸进行滴定 消化 蒸馏 吸收 滴定

10 三、试剂(已制备) 1、消化液:硫酸 2、催化剂:硫酸铜、硫酸钾 3、碱溶液:40%氢氧化钠 4、吸收液:2%硼酸 5、混合指示剂:
0.1%甲基红乙醇溶液:0.1%甲基蓝乙醇溶液=(1:1) 6、标准滴定液:0.2M HCL

11 四.实验步骤 步骤一 步骤二 步骤三 消化 蒸馏、吸收 滴定

12 (一)消化 观察浓硫酸刚加入牛奶中的颜色? 作用? 1、标记消化瓶 2、将下列物质加入消化瓶:
牛奶1ml、浓硫酸5ml、催化剂( K2SO4, CuSO4 )、玻璃珠 3、将消化瓶放入智能数控消化炉进行消化,至 液体变为无色或淡蓝色 250℃ 1h左右 350℃ 40min左右 450℃ 2.5h左右 作用?

13 (二)蒸馏、吸收 传统装置 微量凯氏定氮蒸馏装置 1:电炉 2:水蒸气发生器 3:螺旋夹 4:小玻杯及棒状玻塞 5:反应室 6:反应室外层
7:橡皮管及螺旋夹 8:冷凝管 9:蒸馏液接收瓶 传统装置

14 半自动凯氏定氮仪 2、准备好吸收液(200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂)并做 好标记
1、确保仪器运行正常、管道内 部干净、管道及其连接口密 封性好 2、准备好吸收液(200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂)并做 好标记 3、将碱溶液及去离子水桶与仪 器连接好,放入盛装消化好 样品的消化瓶,放入盛装吸 收液的锥形瓶并保证管口插 入液面下。 4、设置并启动程序 半自动凯氏定氮仪

15 程序设置: 步骤 加碱或加水 时间 蒸馏 C0(样品检测) E0(加碱) 5s E0 4min C1(样品间清洗) E1 0s 2min

16 (三)滴定: 终点 至灰色或蓝紫色 至灰色或蓝紫色 至灰色或蓝紫色

17 五、结果计算: X:样品蛋白质含量 (g/100g 或g/100mL) V1、V2:测定用样、试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积 (mL)
C:盐酸标准液的摩尔浓度 (mol/L) 0.014:1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的克数 m:样品质量(g)或体积(mL) F:蛋白质换算系数6.25

18 六、注意事项: 1、严禁酸碱污染吸收液、所用去离子水及管道等。 2、固体样品消化时防止挂壁且注意梯度升温。
3、硫酸钾提高反应温度,但不可过多,否则温度过多,引起生成 的铵盐分解产生氨,影响结果。 4、硫酸铜起催化剂作用并可指示消化终点。 5、注意标记。 6、取消化瓶时防止烫伤。 7、吸收前确保管口插入液面,吸收结束后使冷凝管下端离开液 面, 并用去离子水将管口冲洗干净并回收至接收瓶。 8、规范滴定操作,且终点判定要一致。

19 定氮法优缺点 优点:灵敏(0.2mg-1mg)、稳定、 成本低廉 凯氏定氮法被定为食品中蛋白质含量测定的现行国家 标准及国际通行的测定方法
缺点:耗时长、特异性差

20 三聚氰胺 化学式: C3N6H6 分子量:126 含氮量:66.6% 牛奶和奶粉添加三聚氰胺,就是因为它能冒充蛋白质
鲜牛奶的151倍,是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺,理论上就能提高0.625%蛋白质 牛奶和奶粉添加三聚氰胺,就是因为它能冒充蛋白质 三聚氰胺

21 1.实验完成后记得清理台面。每组的小组长负责。
2.实验报告: 实验题目 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 (空白滴定的结果可以共享) 实验讨论 (操作中现象的出现原因;结果的影响因素;与商标 上显示的结果对比等。) 结果每个小组可以相同,但是讨论不能相同!


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