第五章 固定化酶和固定化细胞.

Presentation on theme: "第五章 固定化酶和固定化细胞."— Presentation transcript:

1 第五章 固定化酶和固定化细胞

2 酶催化剂使用过程中的缺点 酶的稳定性较差。 酶一般都是在水溶液中与底物反应。 酶反应后成为杂质与产物混在一起，给产物的分离纯化带来困难。

3 固定化酶（Immobilized Enzyme）——
被局限在某一特定区域上的、并且保留了它们的催化活力，可以反复、连续使用的酶。 过去称其为水不溶酶或固相酶。 1971年第一届国际酶工程会议上正式建议采用固定化酶的名称。 根据酶的分类，固定化酶和经过化学修饰的酶、用分子生物学方法在分子水平上改良的酶一起属于修饰酶。

4 固定细胞（Immobilized Cell）——
就是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。

5 本章主要讲授内容 一、酶和活细胞的固定方法 二、辅酶和辅基的固定 三、固定化酶的性质 四、固定化对酶反应系统的影响
五、固定化酶和固定化细胞的应用

6 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺.
一、 酶和活细胞的固定方法 1、固定化酶与固定化细胞的优缺点 固定化酶的优点： 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺. 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 较能适应于多酶反应。 酶的使用效率提高，成本低。

7 （1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。
固定化酶的缺点： （1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 （2）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后．才能固定化。

8 固定化细胞的优点: （1）省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 （2）细胞生长快、而且多、反应快。 （3）可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 （4）保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。

9 固定化细胞的缺点： （1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 （2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解。
（3）细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 （4）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。 （5）使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响产品质量 。

10 2、酶的固定化方法 酶的固定化方法有：吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法。 如下图:

11

12 2.1 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。
（1） 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶。常用的载体有： ①有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6—磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。

13 无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。
②无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 如:用多孔硅胶为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的α-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应．半衰期分别为14d、35d、60d。 无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。

14 （2）离子交换吸附法: 将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。
酶吸附较牢，在工业上具广泛的用途。 常用的载体有阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）—纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、900等。 阳离子交换剂基：如羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、Dowex—50等。

15 DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀．用0.5 mol/L NaOH和水洗涤后，加入pH 的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/ml·h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液) ，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。 固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰-DL-A1a活力为 umol/g·h湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE—纤维素。 此外，DEAE—纤维素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。

16 影响酶吸附与解吸的因素：介子中的离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性等。
pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将明显减少。盐对吸附的影响较为复杂，在一些特殊事例中盐可以促进蛋白质的吸附，即盐析吸附。 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。 载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附。

17 吸附法的优点： 操作简单；可充分选择不同电荷、不同形状的载体；吸附过程可以同时纯化酶；固定化酶在使用过程失活后可重新活化；载体可以回收再利用。 吸附法的缺点： 由于有些机理不十分明了，酶量、吸附程度与固定化酶活力回收关系的不可预见性大；吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。

18

19 2.2 包埋法 包埋法：指将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中而使酶固定化的方法。 常用载体: 主要有琼脂（糖）、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。

20 优点：包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未发生化学反应，可以制得较高活力的固定化酶．对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。
缺点：只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。 包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。

21 （1）凝胶包埋法 ：将酶分子包埋在凝胶格子中。
① 聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程：将1mL溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3mL溶液中，再加0.5ml 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25℃保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒．于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。

22

23 ② 辐射包埋法。 酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中．在常温或低温下，用x—射线、Y—射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X—射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年H．Maeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或稍微疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于—般生物物质的固定化。 生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。

24 ③ 其他凝胶包埋法。 a.淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。为增强机械强度可加入—定量的甘油。 b.胶原包埋法即大分子络合法。胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。

25 c.卡拉胶包埋法：卡拉胶(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将100g酶在37—50℃溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40一60 ℃溶于34ml生理盐水中，二者混合后10℃冷却，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒，即为固定化酶。

26 d.天然血纤维包埋法：血纤维不会引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的谷氨酰胺残基之间发生交联而将酶固定化。
e.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60℃用碳酸镁处理使其凝结，过滤．制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化．从而制得固定化葡萄糖异构酶。

27 (2) 微囊化法 是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触．从而增加了酶的稳定性。 微囊一般直径约1～100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。 如固定化天门冬酰胺酶（治疗白血病）就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。

28 ① 界面沉淀法。 是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂．使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。常用的高聚物有：硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。

29 ② 界面聚合法。 是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体（如乙二醇）用一种水不溶性的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂的疏水单体（如多异氰酸）溶液在搅拌下加入到上述乳化液，在乳化液中水相和有机溶剂之间的界面便会发生聚合反应，这样水相中的酶便被包埋在聚合体膜内。

30 ③ 液体干燥法。 是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中。加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化。在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用的聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。

31 ④ 红血球包埋法。 在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球．再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出来.

32 2.3 共价键结合法 是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。 优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落。 缺点：反应条件较剧烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。

33 （1） 酶分子和载体连接的功能基团。 ①酶蛋白N-端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。 ②酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的β-羧基和Glu残基的γ-羧基。 ③Cys残基的巯基。 ④Ser、Tyr、Thr残基的羟基。 ⑤Phe和Tyr残基的苯环。 ⑥His残基的咪唑基。 ⑦Trp残基的吲哚基。 在实际操作中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环，被偶联的基团必需是酶的非必需基团，否则将导致酶失去活性。

34 (2) 载体的选择 ① 一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。 ② 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③ 载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ④ 载体没有或很少有非专一性吸附。 ⑤ 载体来源容易、便宜、并能反复使用。

35 2.4 交联法 就是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。
2.4 交联法 就是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。 最常用的交联试剂是戊二醛和双重氮联苯胺-2，2’二磺酸。

36 用戊二醛交联制备固定化酶的反应

37 交联法常与吸附法或者与包埋法配合使用， 目的是使酶紧紧地结合于载体上。 ① 酶与载体结合牢固，使用周期长。 特 点 ② 酶活力丧失较大。
特 点 ① 酶与载体结合牢固，使用周期长。 ② 酶活力丧失较大。 ③ 制成的固定化酶或菌体颗粒小，使用不 方便。 交联法常与吸附法或者与包埋法配合使用， 目的是使酶紧紧地结合于载体上。

38 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。
(1) 交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。 这种反应与酶和试剂浓度、溶液pH和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。 如木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊二醛、pH5.2—7.2、0℃下交联24h，可形成固定化酶。其中，pH的影响十分明显，随pH升高，固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。 有人认为pH应控制在酶的等电点附近有利于固定化。

39 (2) 酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联。 从而制备固定化酶。由于酶在交联反应过程中 因化学修饰而引起失活，可得到的酶量有限时。 通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、 胶原、抗体等，与酶一起进行交联。

40 (3) 载体交联法 是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含18.6％CaC12和18.6％水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl中45℃水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5％戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制)，于20℃搅拌交联20min，用PH mol/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。2g处理载体(尼龙)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于4—5℃下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。

41 小 结:

42 四种固定化酶制备方法的特点 易 强 高 无变化 可能 物理吸附 包埋法 共价结合法 共价交联法 制备 结合力 酶活力 底物专一性 再生
难 结合力 弱 强 酶活力 高 中 底物专一性 无变化 有变化 再生 可能 不可能 固定化费用 低 制法 特性

43 3 细胞的固定化方法 分类方式 固定化细胞 细胞类型 微生物细胞 植物细胞 动物细胞 生理状态 死细胞 完整细胞、细胞碎片、细胞器 活细胞
3 细胞的固定化方法 分类方式 固定化细胞 细胞类型 微生物细胞 植物细胞 动物细胞 生理状态 死细胞 完整细胞、细胞碎片、细胞器 活细胞 增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞

44 固定化死细胞：在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。

45 固定化活细胞 固定化静止细胞和饥俄细胞。在固定化之后细胞是活的，但是由于采用控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。
固定化生长细胞又称固定化增殖细胞。是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。更适合于进行多酶顺序连续反应。

46 3.1 固定化微生物细胞 固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞的固定化。 可采用微生物自身的絮凝能力来制备无载体固定化细胞。
要求保持高的催化活力和具有操作稳定性。

47 将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。
(1) 包埋法 将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。 1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆茵而成的。 美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。

48 (2) 吸附法 吸附法也分物理吸附法和离子交换吸附法 ① 物理吸附法 物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。 载体常用多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。 物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大，但细胞极容易脱落而流失。

49 ② 离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离于交换树脂。 如利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用离子交换纤维素吸附无色杆菌(含头孢霉素酰化酶菌株)以及用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功。 这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞。

50 (3) 不用载体法 选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。 如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60℃，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。 又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。

51 二、 辅基与辅酶的固定 对于与酶结合牢固的辅基，可以考虑在固定化酶时将辅基同时固定。 酶蛋白与辅酶结合弱而容易丢失，必须先将辅其固定。

52 三、 固定化酶的性质 （一）影响固定化酶性质的因素： 酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
载体的影响：分配效应；空间障碍效应；扩散限制效应。 固定化方法的影响：

53

54 （二）固定化酶的性质 1.固定化后酶活力的变化 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。
例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30％，而对低分子底物苯酞精氨酸－对硝基酰替苯胺的活力保持80%。 一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。

55 酶活低的可能原因 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。
固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用。 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻。。 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。

56 酶活反而升高的原因 原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰；或固定化过程提高了酶的稳定性。

57 1.1 固定化酶活力的测定 固定化酶的活力，即是其催化某一特定化学反应的能力，大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。
即每毫克干重固定化酶每分钟转化1µmol底物或形成1µmol产物的酶量为一个单位(µmol/mg·min)；对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示，即µmol/min·cm2 。

58 测定固定化酶活力需要标注的条件： 温度； 搅拌速度； 固定化酶的干燥条件； 固定化的原酶含量或蛋白质含量及用于固定化酶的原酶比活力。

59 活力测定方法 活力可在两种基本系统中进行测定——填充床或均匀悬浮在保温介质。
① 间歇测定 在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下（如均匀悬浮于保温的介质中）进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。

60 ② 连续测定 将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力（酶的形状可能影响反应速度）。 在实际应用中，固定化菌不一定在底物饱和条件下反应，故测定条件要尽可能与实际工艺相同，这样才能利于比较和评价整个工艺。

61 1.2 偶联效率及相对活力的测定 用于表征影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活。
固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶所显示的活力占被固定的等当量游离酶总活力的百分数。

62 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力x100％

63 活力回收也可称为有效系数、活力保留百分数、偶联效率，它表示影响酶固有性质诸因素的综合效应。
静态有效系数(η)是在起始速度条什下测得的活力回收。 操作有效系数(η')是在生产设备所要求的条件下测量的，是固定化酶制剂实用性的最有效数据之一。

64 η(或η')＝1 表示反应控制良好，固定化或扩散引起的酶活力损失不明显(这种可能性不大)。
η(或η')＜1 表示固定时有损失，扩散限制有影响。 η(或η')＞1 可能发生在个别情况。原因可能是固定化活细胞的增殖或抑制因素的排除。

65 2 固定化后酶稳定性的变化 大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性，延长了有效寿命。这是由于： 第一，固定化增加了酶构象的牢固程度。
第二、挡住了不利因素对酶的侵袭。 第三，限制了酶分子间的相互作用。 但是，如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降。

66 2.1 热稳定性的变化 大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性。

67 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。
由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80 ℃，比固定化前提高了30 ℃。

68 如氨基酰化酶：溶液酶在75℃保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下活力仍有80％；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60％活力。
固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高，这种性质对酶在工业上的应用具有重要意义。 固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5～15℃。 但有时固定化酶的热稳定性和最适温度都低于溶液酶的。

69 2.2 pH稳定性的变化 反应的最适pH发生偏移； pH稳酶定性增强。

70 固定化前后的天冬酰氨酶 活力—pH曲线 1—固定化酶 —游离酶

71 最适pH偏移的原因 ①载体所带电荷影响酶所在的微环境。 一般情况下，用带负电荷的载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的PH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。 反之，使用带正电荷的载体其最适PH向酸性偏移。

72 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定限制。
②产物对最适pH的影响。 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定限制。 + 催化反应产物为酸性（H+），则最适pH比游离酶高（需OH-中和）；反之则偏低；中性则不变。

73 2.3 对蛋白酶的抵抗力提高 溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。 如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20％，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80％的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中。

74 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。
2.4 对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。 例如：氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol/l脲素、2mol/l胍、1％SDS和4mmol/l丙酮溶液中活力分别为9％、49％、1％和55％，而后者在相应溶液中活力则分别为146％、117％、35％和138％。

75 2.5 操作稳定性增强 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期(t1/2)，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间)较长。半衰期可按下式计算：
式中ED为反应时的酶浓度，E为原有酶浓度。一些固定化酶的半衰期如下表:

76

77 2.6 贮藏稳定性的变化 大多数酶经固定化后贮藏稳定性提高了。 如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4℃下，120天酶活力无变化。

78 3 底物特异性的变化 由于存在空间位阻，可能不再作用于分子量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右。

79 4 固定化酶米氏常数(Km)的变化 固定化酶的表观米氏常数Km，随载体的带电性能变化。

80 四、 固定化酶与固定化细胞的应用 （1）生物化学及分子生物学基础研究 （2）药物控释载体 （3）生物传感器 (4) 环境保护与监测

81 课后作业 1、什么叫固定化酶？与水溶性酶相比，固定化酶有哪些优点？ 2、酶的固定化方法有哪些？ 3、哪些因素影响固定化酶的性质？
4、共价键结合法固定化酶的优缺点各是什么？ 5、大多数酶在固定化后都不同程度地提高了其稳定性，延长了有效寿命，原因是什么？