高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸.

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1 高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸

2 一.  实验目的：  1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量分析方法。

3 二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。

4 由于80%的有机化合物都可以用高效液相色谱法分析，目前已经广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境检测、石油化工等行业。
根据使用的固定相及流动相的极性不同，分为正相液相色谱和反相液相色谱：固定相为极性，流动相为非极性的液相色谱色谱称为正相液相色谱（固定相为硅胶和氧化镁，流动相为正己烷，醚等）；固定相为非极性，流动相为极性的液相色谱色谱称为反相液相色谱（固定相为碳粒和氧化铝，流动相为水、醇等）。

5 （1）定性分析： 液相色谱法可以分离有机化合物，在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系数K： K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流动相中的浓度） 显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短，由于组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从而达到分离的目的。 一般情况下，当外界条件及方法确定，溶质流经色谱柱时，不同分配系数的物质流出色谱柱的时间不一致，在检测器上得到响应，表现为出峰时间不一致，同一组分（K值固定），保留时间To一致，根据这个特性，可以分离不同的有机化合物。

6 （2）定量分析（ESTD法）： 用高效液相色谱法测定未知样品中的苯甲酸含量，将已配置浓度不同的苯甲酸标准溶液也进入色谱系统，绘制浓度——峰面积的标准曲线。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间 （T0或保留距离）和峰面积A后，可直接用 T0 定性，用峰面积作为定量测定的参数，注入未知样品后，得知未知样品的峰面积，查标准曲线，求出未知样中的苯甲酸的含量。

7 三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。

8 四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂，用纯水或去离子水溶解，定容到100毫升，浓度为1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水=60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上），注入进样阀中。

9 4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站开始记录并出图11。
5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次，获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。

10 六．数据分析 1. 根据标准样品色谱图中的保留时间，找到并标出饮料色谱图中的苯甲酸的色谱峰位置。 2．根据图11，12，13，14，15的浓度和峰面积，作苯甲酸的标准曲线， 在标准曲线，求得未知中苯甲酸的浓度。

11 七．问题讨论 1．用框架图画出HP1100液相色谱仪的构造流程。 2．用正相色谱柱可以进行苯甲酸的定性和定量分析吗？溶剂怎么选取？ 3．在本实验中，用峰高h为定量基础的校正曲线能否得到苯甲酸的精确结果？