实验 六 凝 胶 过 滤 层 析.

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1 实验 六 凝 胶 过 滤 层 析

2 一 实验原理 凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱，使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。

3 一 实验原理 所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间进行扩散分配的差异造成较小的分子在柱中停留的时间比大分子停留的时间要长，所以整个样品按分子大小顺序而分开，最先洗脱出来是最大的分子。

4 一 实验原理 其定量关系符合以下公式： Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积
一 实验原理 其定量关系符合以下公式： Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数

5 二试剂和器材 1．试剂 Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液

6 二试剂和器材 2．器材 （1）带夹套层析柱：φ：h=1:24 （2）加样器 （3）分部收集器 （4）核酸蛋白检测仪 （5）小玻棒

7 三 操作步骤 1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排阻限为 。 称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。

8 三 操作步骤 2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级分离，要求柱床体积大于样品体积25倍以上，最高可达100倍，层析柱的径高比也在25-100之间。为了减少温度对分离蛋白质活性的影响，层析柱外加夹套，通入低温循环水，以保持低温。

9 三 操作步骤 3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度的凝胶悬液缓慢灌入层析柱中。灌胶前应打开柱端阀门，保持一定流速。灌装过程中，为防止管壁效应，边灌装边搅拌，使凝胶颗粒均匀沉降。 对于装好的层析柱，先察看有无凝胶分层、沟流、气泡等现象。如果没有这些现象，就用2倍以上的柱床体积的洗脱液按正常操作流速过柱，以稳定柱床。加液前最好在床面上加上快速滤纸片，防止加液时冲动床面，破坏床面平整。为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用大分子有色物质溶液过柱，观察柱床有无断层、沟流，色带是否平整。常用0.2%-0.3%的兰色葡聚糖溶液（兰色葡聚糖分子量为2000kd），加入量为每平方厘米床面 毫升。同时也可测定层析柱的外水体积。兰色葡聚糖在260nm及610nm处各有一个吸收峰。

10 三 操作步骤 4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。
将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱液洗涤表面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。

11 三 操作步骤 5 洗脱与收集 为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器检测洗脱峰。

12 三 操作步骤 6层析柱再生 层析柱在合理使用情况下一般无需再生即可多次重复使用。如长期使用会造成层析柱板结，不溶物污染及严重吸附等，影响流速或分离效果，因此需要再生。最简单的方法是用水反冲。 7 目的蛋白检测

13 四 思考题 1 制备型凝胶柱层析洗脱液检测与收集经常分流，为什么？ 2 SephadexG-75凝胶柱操作压与流速控制在多大范围比较适宜？