Chromatography.

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1 Chromatography

2 Chromatography The mixture is dissolved in a fluid called the mobile phase, which carries it through a structure holding another material called the stationary phase. The various constituents of the mixture travel at different speeds, causing them to separate.

3 層析法中的移動相（mobile phase；即流經管柱 的溶劑）通常是液體或氣體。
靜相（stationary phase；固定於管柱內部的物質） 又稱固定相，則是固體或附著於固體或是毛細 管柱內壁的液體。 在氣相層析法（gas chromatography）中，移動 相為氣體，而在液相層析法（liquid chromatography）中，移動相則是液體。 P.434

4 進入管柱的流體稱為沖提液（eluent）；離開管 柱的流體稱為析出液（eluate）；將液體或氣體 通過層析管柱的過程則稱為沖提（elution）。
P.434

5 18-2 我們如何描述層析圖 層析圖（chromatogram）所顯示的是在一個層 析實驗中隨著時間進行（或沖提體積），偵測 器的感應訊號大小（圖 18-3）。 滯留時間（retention time；tr）則是指某個溶質 在注射後到達偵測器所需要的時間。 P.436

6 圖 18-3 圖 以圖示方式說明層析圖相關參數，包括滯留時間（tr）與半高峰寬（w1/2）。在基線的成分峰寬度（w）是由成分峰所顯示的高斯曲線斜邊延伸與基線相交的點所決定，高斯曲線的標準偏差為 σ。在氣相層析法中，通常注射 0.1 μL 至 0.2 μL 的甲烷所出現的時間可被視為層析中最早出現的時間，也經常被視為移動動相在管柱中所滯留的時間。　 P.437

7 圖 18-4 圖 18-4　兩個相同面積與高度的高斯峰之間的解析度。虛線部分為個別單一的成分峰，實線則是兩個成分峰的面積和。重疊部分則以陰影表示。 P.438

8 定性與定量分析 在定性分析的應用方面，要確定層析圖中的成 分峰是哪種成分最簡單的方法是比較已確定物 質與待測物質兩者的滯留時間。更可靠的方式 是利用標準添加法（spiking；也稱 co- chromatography）。 在定量分析上，成分峰的面積與分析物的量成 正比例。 比較面積法與內標法兩種定量方式，後者會得 到比較好的分析物濃度結果。 P.438

9 由溶質與靜相的作用力不同可以將層析法分成:
吸附層析法（adsorption chromatography） 分配層析法（partition chromatography） 離子交換層析法（ion-exchange chromatography） 分子排除層析法（molecular exclusion chromatography） 親和層析法（affinity chromatography） P.435

10 18-9 離子交換層析法 離子交換層析法（ion-exchange chromatography） 以離子性溶質與靜相中帶電荷位置之間的作用力 為分離的基礎（圖 18-2）。 陰離子交換介質（anion exchanger）在靜相上具有 帶正電荷的官能基，能夠吸引陰離子。 陽離子交換介質（cation exchanger）則含有陰離 子官能基，能夠吸引陽離子。 陽離子交換樹脂是將帶負電荷的磺酸根（－SO3－） 或羧酸根（－CO2－）接到聚苯乙烯苯環上（圖 18- 48）。 P.480

11 Ion exchange chromatography
R+A- + B R+B- + A-

12 圖18-33　 圖18-48　聚苯乙烯離子交換樹脂的結構，不同的高分子鏈之間以共價鍵方式交聯在一起。 P.480

13 離子交換選擇 上述反應的平衡常數稱為選擇係數（selectivity coefficient）
離子的水合半徑（hydrated radius） 是指離子本身的有效半徑加上周圍 被離子的正電荷或負電荷（圖 11-3） 所緊緊束縛的水分子。 P

14 在圖 18-49 中，利用改變 [H＋] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子（M3+）分離。
以下是某些離子對樹脂的大略趨勢： 在圖 中，利用改變 [H＋] 的梯度沖提將不 同鑭系陽離子（M3+）分離。 P.482

15 圖18-34　 圖18-49　利用陽離子交換管柱以 H＋ 梯度沖提的方式（25 分鐘內 mM HNO3）沖提鑭系(III)元素，梯度沖提可以將牢固的滯留於靜相上的陽離子趕出來。 P.482

16 18-11 分子排除層析法 在分子排除層析法（molecular exclusion chromatography），也稱 為凝膠過濾層析法或凝膠滲透層析法中，分子藉著分子大小不同 而分離。 由於小分子在管柱中的路徑較長，大分子會先被沖提出來（圖 ）。 這個技術廣泛的應用在生化與高分子化學領域中，藉著這個技術 可以純化巨分子與測定巨分子的分子量（圖 18-55）。圖 是一個應用在材料化學的例子。 P.485

17 Gel filtration chromatography

18 圖18-39　 圖18-56　以分子排除層析純化奈米碳管。 P.486

19 Gel filtration chromatography
V0：void volume Ve：elution volume

20 分子量測定 滯留體積（retention volume）是指要將某一個特定溶質沖提出來 所需要的移動相體積。 P.486

21 解 範例 3 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析，記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積（Vr），請求出待 測物的分子量（MM）。
以凝膠過濾層析法測定分子量 以凝膠過濾層析法進行蛋白質層析，記錄不同分 子量標準品與未知物的滯留體積（Vr），請求出待 測物的分子量（MM）。 解 P.487

22 圖18-57 分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。
圖18-40　 圖18-57　分子排除層析法中依照不同分子量與滯留體積 所得到檢量線。 P.487

23 18-12 親和層析法 親和層析法（affinity chromatography）可以分離複雜組成樣品中 某一個特定的單一化合物。

24 fusion protein: 6-histidine tag 24

25

26 Antibody-Au nanoparticles
金奈米粒子的應用: 驗孕片之原理 (免疫層析法)

27 18-6 氣相層析法 在氣相層析法（gas chromatography）中，氣態的移動相負載著氣 態的溶質通過內含有靜相的長且細的管柱。 管柱 開管式管柱（圖 18-19）的靜相可能是液體或固體，塗佈在內側 管壁（圖 18-20）。 表 18-2 的液態靜相涵蓋了很寬的極性範圍。欲將混和物分離，選 擇靜相的基本原則是「相似者互溶」。 P

28 圖 18-15(b) 圖18-22　分離 22 種帶有 1，2 或 3 個雙鍵的 18 碳脂肪酸酯甲基酯。圖 4-3 中的脂肪酸標示在成份峰 3，7 與 14。所使用的管柱是 supelco IL100 離子液體管壁塗布開管式毛細管柱（100 m × 0.25 mm 內徑，靜相膜厚 0.20 μm），工作溫度為 150ºC，載流氣體為 H2，線性流速為 25 cm/s，偵測器為火焰離子偵測器。 　　 P.457

29 計畫升溫法 圖 所顯示的是對於從沸點 69ºC 的 C6H14 到 356ºC 的 C21H44 的非極性混合物以計畫升溫 法分離的效果。 P

30 圖 18-18 圖 以 (a) 等溫與 (b) 計畫升溫方式分離直鏈烷類，所使用的管柱為填充式非極性管柱。(a) 的偵測靈敏度比 (b) 高 16 倍。　 P.459

31 18-7 古典液相層析法 靜相 溶劑 對於吸附型層析來說，氧化矽（SiO2．xH2O； 也稱為矽酸）是常用的靜相之一。
在吸附型層析中，溶劑與溶質互相競爭吸附在 靜相的活性位置。 不同溶劑之間對於從管柱中沖提出特定溶質的 能力與溶質的本質無關。 P.466

32 圖 18-22 圖 溶劑分子與溶質分子對靜相上發生作用力的位置互相競爭。 溶劑分子與靜相的作用力越強，沖提強度也越大。 　 P.466

33 18-8 高效能液相層析法 高效能液相層析法（high-performance liquid chromatography； HPLC）利用高壓將沖提溶劑推入填充微米級靜相顆粒的管柱中， 這些微米級的靜相顆粒提供了非常良好的層析分離。 在圖 中的分析級 HPLC 設備所使用的管柱內徑約在 1-5 mm 而長度在 5-30 cm，理論板數為每公尺 50,000 至 100,000 板數。 P.468

34 圖 18-23 圖 連接質譜儀作為偵測器的高效率液相層析儀（HPLC）。右圖為管柱放大圖。實際操作時，管柱烘箱會關上，才能維持固定溫度。 P.468

35 液相層析質譜法 電噴灑法（electrospray）是一種成功的應用技術。這種方式藉著 高電壓方式讓移動相變成霧狀由噴口噴出。
另外一種將沖提物導入質譜儀中的方式為大氣壓化學游離法 （atmospheric pressure chemical ionization），見圖 18-44。 圖 是經由質譜儀以選擇離子反應法測定所得到的層析圖。 P.476

36 圖18-51　 圖18-44　大氣壓化學游離裝置在液相層析管柱與質譜儀之間的介面。藉由噴霧口的氣體與加熱器產生霧狀氣溶膠。由針尖的電子環形暈所放出的電子可以將分析物變成離子狀態。 P.477

37 親水性作用層析 親水性作用層析（Hydrophilic Interaction Chromatography；HILIC）應用在分離那些極性 太高以至於逆相層析無法滯留的分子。 圖 顯示抗壞血酸（維生素 C）與異抗壞 血酸的層析分離圖譜，兩者在結構上只有在一 個碳（C5）有差別。 當溶液 pH 7 時，胺基會完全質子化。移動相為 90：10（體積/體積）乙腈與含 0.1 M 醋酸氨的 水溶液，圖 顯示，當乙腈的含量增加時， 化合物的滯留時間會增加，這個行為與逆相層 析的趨勢相反，在逆相層析中，乙腈含量增加 滯留時間會縮短。 P

38 圖18-51　 圖18-46　以親水性作用層析分離抗壞血酸與異抗壞血酸。以表 18-4 的胺基鍵結管柱做為分離靜相，移動相組成為 90：10 乙腈：H2O（含 0.1 M 醋酸銨）。 P.479

39 薄層層析法

40 彩色插圖 19 彩色插圖 薄層層析法（18-1 節）。(a) 溶劑上升通過靠近底部的染料混合物，平板上塗佈有吸附劑。(b) 當溶劑上升至接近平板頂端時，完成分離過程。