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第五章 基因治疗 经典的基因治疗是指在基因水平上对遗传缺陷进行纠正，它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因的DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。它通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。
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一、基因治疗的主要原理 （一）基因治疗的基本组成元件 载体（病毒载体、非病毒载体）、转导基因。 （二）基因治疗的原理
基因增补是将正常的目的基因导入病变细胞或其它细胞， 基因替换是用正常基因原位替换致病基因 基因修复对异常基因在原位进行修复，纠正致病基因的突变碱基序列， 基因失活是抑制一些有害基因表达，达到治疗的目的。 免疫调节是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变其免疫状态。
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二、基因治疗的途径 （一）直接导入法（in vivo）
将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体中，直接通过如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等方式，导入受体体内有关的器官组织和细胞内。 （二）间接导入法（ex vivo） 即先在体外将外源基因导入载体细胞然后导入人体自身或异体细胞（或者异种细胞），经体外扩增，然后将基因转染后的细胞，回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物。
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第二节 病毒载体 常用的病毒载体： 包括逆转录病毒（RV）、腺病毒（AV）、单纯疱疹病（HSA）和腺相关病毒（AAV）等
病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对机体不致病。
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（一）反转录病毒（RV）载体 属于正链RNA病毒，反转录病毒科，有2条相同的正链RNA分子，每个单链RNA可分为六个区域： 5’-LTR；Ψ+； gag； pol； env； 3’-LTR。 反转录病毒载体优点：（1）感染率高；（2）可高效整合到宿主基因组中；（3）宿主范围广泛；（4）免疫原性低；（5）在细胞内不易降解。 反转录病毒载体缺点：（1）不能感染非分裂的细胞；（2）外源DNA 整合时可能导致突变；（3）包装外源基因容量有限，小于10kb；（4）表达不稳定并且难以控制；（5）要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体；（6）制备纯化复杂。
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（二）腺病毒（AV）载体 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，病毒颗粒是二十面体。基因组长约30-36kb，含有14个基因，两端各有一个反向末端重复区（ITR），基因组上分布着四个早期转录元件（E1、E2、E3、E4）为外源基因洞察入位点。 腺病毒载体优点：（1）基因组大，因而可插入大片段外源基因；（2）可高效地转导不同类型的人组织细胞；（3）可转导非分裂细胞；（4）在细胞培养物中有高滴度的重组病毒，产量稳定，易于制备与纯化；（5）进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高；（6）可原位感染，不仅可通过静脉注射，还可经口服，喷雾，气管内滴注等途径进行治疗；（7）外源基因表达水平较高。 腺病毒载体的缺点：（1）免疫原性较强；（2）靶向性差，几乎可以感染所有的细胞；（3）因不能整合到宿主染色体上，所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予载体制剂治疗。
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（三）腺相关病毒（AAV）载体 非致病性的细小病毒科，线性单链的DNA病毒，基因组在4.7-6kb之间，
腺相关病毒载体优点：（1）目前尚未发现该病毒在人体中致病，所以比较安全；（2）感染宿主细胞广泛，包括非分裂细胞和分裂细胞，特别是能够感染神经元和神经胶质细胞；（3）能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减少了插入突变的可能性；（4）外源基因表达稳定，可达到3个月至1.5年，（5）反向末端重复序列中没有转录调控元件，这样减少激活原癌基因的可能性。 存在的不足是：（1）需腺病毒辅助复制；（2）不能插入较大的外源基因，小于4.7kb；（3）缺少高效的包装细胞；（4）制备纯化复杂。
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第三节 非病毒载体 非病毒载体的优点：低毒、低免疫反应、不发生外源基因随机整合
非病毒载体对种类：包括裸DNA（naked DNA）、脂质体载体（liposome vector）及阳离子多聚物型载体（cationic polymer vector）等。
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二、非病毒载体的分类及特点 （一）裸DNA
裸DNA（naked DNA），该类载体要通过直接的物理或机械方法，导入机体特定部分，避开胞内外屏障而发挥作用。当将它应用于激发免疫反应时可称做DNA疫苗（DNA vaccine）。 DNA载体的导入方法：基因枪（gene gun），这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，通过高压电所产生的高能电弧促使DNA被包的金属颗粒产生高速度，能有效的穿透单层细胞或是靶器官将DNA导入靶细胞或者组织中，
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（二）脂质体/DNA复合物 1、阳离子（cationic）脂质体
它可作为负电荷物质的传递载体，特别适用于蛋白质、多肽和寡核苷酸类物质DNA、RNA。 2、阴离子（anionic）脂质体 由于阴离子脂质体带负电荷，必须在脂质体中加入钙离子方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运的寡聚核苷酸首先定位于细胞核，也延长了寡聚核苷酸在细胞内的保存时间。 3、温度敏感脂质体 4、pH敏感脂质体 6、前体脂质体（proliposome） 7、磁性脂质体 8、聚合膜脂质体
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第四节 基因治疗的研究进展 囊肿性纤维化（cystic fibrosis）的基因治疗
疾病简介： 囊肿性纤维化：该病是由于机体自身CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）基因即囊肿性纤维化转膜离子通道调控子基因缺失所引起的，该基因的突变或缺失导致上皮细胞氯离子转运通道受阻，表现为上皮氯化物运送缺陷，稠的浓缩分泌物阻塞于支气管、胆道系统、胰腺和消化道。阻塞支气管可引起反复肺部感染，支气管扩张，呼吸衰竭；阻塞胆道系统可引起胆囊管发育不全，胆汁性肝硬化；阻塞胰腺导管可以引起胰腺机能不全和胰腺炎；阻塞消化道可以引起新生儿的胎粪性肠梗阻
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囊肿性纤维化基因治疗的研究进展 病毒载体（逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等）针对与CFTR基因缺失有关的治疗效率不是很高，因为机体本身会对其产生免疫而且还有细胞毒作用，同时因为本身的膜表面病变和缺乏与相关病毒载体亲合力强的受体，影响了载体与靶细胞的结合效率，从而影响治疗效果。 非病毒载体在治疗CF疾病上，虽然克服了免疫原性、基因突变和内毒素等方面的影响，但是其效率要比病毒载体低很多。
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基因治疗的实例 商品名：今又生（Gendicine) 通用名：重组人p53腺病毒注射液
英文名：Recombinant Human Ad-p53 Injection 注册商标：今又生（Gendicine） 主要组成成分：重组腺病毒-p53基因颗粒 适应症：本品与放射治疗联合可试用于现有治疗方法无效的晚期鼻咽癌的治疗 用法用量：在放射治疗前72小时开始瘤内注射。每周一次，每次1012VP，四周为一个疗程。根据病情，可使用1-2个疗程。 批准文号：国药准字S 生产企业：深圳市赛百诺基因技术有限公司
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今又生药理作用 本品是由5型腺病毒载体与人p53基因重组的肿瘤基因治疗制品。研究表明，p53基因指导合成P53蛋白，在正常组织中，P53蛋白的表达量很低，在受到DNA损伤等刺激时，P53蛋白表达量升高，发挥细胞增殖调控作用，抑制细胞分裂，诱导细胞凋亡；不同类型的肿瘤中，p53基因突变频率可高达50～70%。本品瘤内注射，可通过腺病毒感染将p53基因导入肿瘤细胞，表达P53蛋白，从而发挥抑制细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而对正常细胞无损伤。高表达的P53蛋白质能有效刺激机体的特异性抗肿瘤免疫反应，局部注射可吸引T淋巴细胞等肿瘤杀伤性细胞聚集在瘤组织。p53肿瘤抑制基因是细胞内关键的"看家基因" ，具有上调多种抗癌基因和下调多种癌基因的活性，并有抑制血管内皮生长因（VEGF）基因和药物多抗性（MDR）基因表达的作用。
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思考题 1、什么是基因治疗 2、基因治疗的基本组成元件 3、基因治疗的原理 4、基因治疗常用的病毒载体
5、囊肿性纤维化（cystic fibrosis）的发病机制
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