肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制

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1 肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制
主讲人：杜标炎 广州中医药大学

2 课题资助情况 国家自然科学基金（编号：30171201;30572433; 30672747 ）
国家自然科学基金（编号： ; ; ） 广东省科技攻关计划（编号：2005B ） 广州市科委（编号：2002J1-C7401） 广东省中医药管理局（编号：A401028； ） 广州中医药大学(K )

3 内 容 HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用 中药方药增效作用的机制
内 容 研究背景及研究思路 HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用 中药方药增效作用的机制 肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作

4 研究背景及研究思路

5 基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法
基因治疗的概念 基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法

6 基因治疗的策略

7 基因治疗的临床试验

8 恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象
肿瘤的基因治疗 恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象

9 目前常用的肿瘤基因治疗方案 肿瘤的免疫基因治疗 肿瘤抑制基因治疗 自杀基因治疗（最有应用前景） 肿瘤多药耐药性基因治疗
抑制血管生成的基因治疗

10 自杀基因的概念 目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡
所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因 目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡

11 目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统
基因名称 底物 产物 旁杀伤效应 备注 单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk） GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷类似物 磷酸化的核苷类似物 有 研究最多 已上临床 水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（VZV-tk） araM araATP － 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD） 5-FC 5-FU 大肠杆菌硝基还原酶（NTR） CB1954，MTZ，NFT 羟胺衍生物 研究正在兴起 大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（EC-XGPRT或gpt基因） 6TG 6TX 6-硫代鸟嘌呤酸 细胞色素P450 CYP 2B1 CPA，IFA 碱性化的底物 细胞羧肽酶G2（CPG2） CMDA 芥类药物 大肠杆菌DeoD 基因（PNP） Mep-dr 6-甲嘌呤 白细胞介素1β转化酶（ICE） RARP，Lamins Rb，U1-70kD等 被降解 失活的底物 p53

12 自杀基因治疗的优势 ①特异性杀伤基因表达细胞 ②杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞
③基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达 ④绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效应”，体外只需有10％以上的肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞 ⑤良好的瘤苗

13 旁杀伤效应

14 旁杀伤效应作用机制 “缝隙连接”机制 免疫介导机制 “细胞凋亡”机制 介质机制 抗肿瘤血管生成

15 缝隙连接机制

16 免疫介导机制 1 2 大量抗原释放 免疫细胞浸润 细胞因子释放 死亡 tk+ 免疫抑制 免疫激活 免疫炎症系统介导的 非特异性杀伤
诱发特异性 抗肿瘤免疫反应 旁杀伤效应增强 2 免疫增强 死亡

17 “细胞凋亡”机制 自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋亡 tk+细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬引起tk-细胞死亡 细胞死亡 tk-细胞

18 介质扩散 5-Fc 5-Fu CD CD-细胞死亡 5-Fu 5-Fu 5-Fu

19 抗肿瘤血管生成 注： 自杀基因

20 单纯自杀基因治疗存在主要问题 目的基因转染率低而杀伤力不足；缺乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织特异性和时序性等，单纯自杀基因治疗难以完全消除肿瘤细胞

21 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 双自杀基因治疗 联合治疗 靶向基因治疗 增强旁杀伤效应 联合免疫基因治疗 联合放射治疗 联合化学治疗
联合其他基因 靶向基因治疗 增强旁杀伤效应

22 自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案
研究思路 单纯自杀基因治疗 载体转染效率低 靶向性不够 易复发 联合治疗增效 肯定的免疫药理作用 多靶点作用 给药方便，价格低廉，毒副作用小或无明显毒副作用 联合免疫基因 联合放化疗 多基因间互相干扰，难以保证导入基因表达或长期表达；使用病毒载体量增多，潜在毒副作用增大；操作过程复杂，成本较高 联合中药方药 提高旁杀伤效应 增强“缝隙连接”功能 增强杀伤敏感性 增强免疫功能 自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案

23 HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

24 技术路线 获得目的基因 病毒滴度测定 酶切酶切鉴定 病毒感染胃癌细胞 质粒重组 斑点杂交鉴定 GCV杀伤试验 重组质粒鉴定 病毒包装和阳性克隆筛选

25 目的基因（tk基因）的获得 由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供 （ pICl9R/MCl-tk质粒）

26 pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果
a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图 b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱 注（b）：1：Marker(λDNA HindⅢ)； ：pICl9R/MCl-tk质粒 3：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ； 4：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ 5：Marker(λDNA /EcoRⅠ+ HindⅢ)

27 重组质粒的限制性内切酶鉴定结果 1 2 3 4 5 6 a：pLXSN-tk质粒结构图 b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱
a：pLXSN-tk质粒结构图 b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱 1．DNA marker Ⅸ(分子量分别为2.5kb, 2.0kb , 1.5kb , 1.0 kb, 500bp, 300bp) 2．pLXSN-tk经EcoR I单酶切 3．4．pLXSN-tk经EcoR I/BamH I双酶切 5． pLXSN-tk质粒 6． DNA/ EcoR I/Hind Ⅲmarker

28 重组质粒的测序图鉴定结果

29 图3 pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果
a：G418筛选5d后的PT67 b：筛选2w后形成的阳性克隆细胞 图3 pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果

30 病毒滴度测定及结果 本实验测定滴度最高为1×104cfu/mL

31 胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的 DNA
胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的 DNA 与tk探针的斑点杂交图 注：1. pLXSN/ tk 质粒DNA（阳性对照）； 2. SGC-7901细胞DNA； 3. SGC-7901/tk细胞DNA

32 GCV对人胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤试验

33 结论及意义 已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统

34 中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用

35 动物水平实验

36 小鼠移植性肝细胞癌治疗实验(六味地黄) H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合 接种小鼠皮下组织 （ 2×106细胞 ） 技术路线
病毒感染肝癌细胞 动物分组 GCV体外杀伤试验 成瘤后治疗 H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合 疗效观察 接种小鼠皮下组织 （ 2×106细胞 ）

37 分组及治疗 正常对照组 模型对照组 六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组 联合治疗组 第2天 第6天 第16天 蒸馏水灌胃每天0.5mL
（生理盐水） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 模型对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 六味地黄丸治疗组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 自杀基因治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1 （造模） （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 联合治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

38 肿瘤生长体积曲线 时间（d）

39 肿瘤质量及抑瘤率 组别 n 肿瘤质量（g） 抑瘤率（%） 模型对照组 19 1.5825±1.2380 六味地黄治疗组
0.8498±0.7163 46.3 自杀基因治疗组 20 0.9904±0.9796 37.4 联合治疗组 18 0.5859±0.3786* 63.0 注：*与模型对照组比较P<0.05 抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%

40 肿瘤质量图示

41 病理检查结果(肉眼观察) 注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组； 第五组：联合治疗组

42 病理检查结果(光镜观察 ) 各组细胞密度 模型对照组 六味地黄丸治疗组 肿瘤细胞数量较多，密集。 肿瘤细胞数量较多，密集。 自杀基因治疗组
肿瘤细胞数量密度相对较少。 联合治疗组 肿瘤细胞数量密度相对较低。 各组细胞密度

43 各组肿瘤坏死情况 六味地黄丸治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织
模型对照组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 六味地黄丸治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 自杀基因治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织 联合治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织。 各组肿瘤坏死情况

44 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况 模型对照组：肿瘤周边纤维组织增生不明显，未见明显包膜
六味地黄丸治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 联合治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较厚的假包膜 自杀基因治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况

45 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况 模型对照组：肿瘤边缘见少量炎细胞浸润 六味地黄丸治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润
自杀基因治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润 联合治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见大量炎细胞浸润 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况

46 肝癌治疗实验结论 自杀基因疗法与六味地黄丸联合应用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有协同效应，表明六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效作用

47 丹参注射液 H22肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片 A 模型对照组； B 丹参组； C tk/GCV组； D 联合组.

48 小鼠移植性黑色素瘤治疗实验 tk＋和tk－细胞按1∶4混合 接种小鼠皮下组织 （ 1×106细胞 ） 技术路线 病毒感染黑色素瘤细胞
动物分组及治疗 GCV体外杀伤试验 疗效观察 tk＋和tk－细胞按1∶4混合 接种小鼠皮下组织 （ 1×106细胞 ）

49 分组及治疗 正常对照组 模型对照组 自杀基因治疗组 六味地黄丸治疗组 联合治疗组 第2天 第7天 第27天 蒸馏水灌胃每天0.5mL
（生理盐水） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 模型对照组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 自杀基因治疗组 腹腔注射生理盐水每天0.25mL （造模） 蒸馏水灌胃每天0.5mL 六味地黄丸治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1 （造模） （造模） 六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1 联合治疗组 腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

50 成瘤时间 六味地黄丸治疗组 自杀基因治疗组 模型对照组 联合治疗组 接种

51 成瘤率

52 肿瘤生长体积曲线 时间（d） 时间（d）

53 肿瘤质量及抑瘤率 组别 n 肿瘤质量（g） 抑瘤率（%） 模型对照组 10 0.9583±1.3260 自杀基因治疗组 11
0.3566±0.8569 62.8 六味地黄治疗组 7 0.4369±0.6937 54.4 联合治疗组 0.1234±0.2538* 87.1 注：*与模型对照组比较 P<0.05 六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据 抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%

54 各组肿瘤质量图示 注：六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据

55 病理检查结果(肉眼观察) 注：B：肿瘤模型组；C：自杀基因治疗组；D：六味地黄丸治疗组； E：联合治疗组

56 病理检查结果(光镜观察 ) 各组细胞密度 自杀基因治疗组 模型对照组 肿瘤组织内可见细胞密集细胞内可见黑色素
模型对照组：肿瘤组织内可见细胞密集，细胞内可见黑色素 六味地黄治疗组 肿瘤组织内可见密集的肿瘤细胞 联合治疗组 肿瘤组织内可见细胞密度稍降低 各组细胞密度

57 各组肿瘤坏死情况 模型对照组 肿瘤内可见大片坏死组织 自杀基因治疗 肿瘤内可见大片坏死组织 联合治疗组 肿瘤内可见坏死组织 六味地黄治疗组

58 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况 模型对照组 肿瘤周围无明显胞膜形成 自杀基因治疗组 肿瘤周围见薄层假包膜 六味地黄丸治疗组：
联合治疗组 肿瘤周围明显的假包膜形成 各组肿瘤纤维结缔组织增生情况

59 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况 模型对照组 肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润 自杀基因治疗组 肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润 联合治疗组
肿瘤间质及周围组织内见多量淋巴细胞浸润 六味地黄丸治疗组 肿瘤周围组织内有较多炎症细胞浸润 各组肿瘤组织炎细胞浸润情况

60 恶性黑色素瘤治疗实验结论 六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性恶性黑色素瘤具有增效作用

61 细胞水平实验

62 技术路线 有效中药成分对肝癌细胞GJIC的影响 中药成分对肝癌细胞的作用 (确定筛选药物及联合用药剂量) 建立大鼠肝癌细胞 tk/GCV系统
对肝癌细胞的杀伤作用 大鼠肝癌细胞 tk -、tk+细胞对GCV敏感性检测 Q值法分析联合作用 是否有协同性 决定采用的GCV浓度 自身旁杀伤效应检测 有效中药成分增效机制探讨 有效中药成分对细胞周期、细胞凋亡率的影响 有效中药成分对肝癌细胞GJIC的影响

63 大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+对GCV敏感性（MTT法，72h）

64 CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+不同混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响(MTT法）
组别 tk+ 细胞比例（％） 存活率（%） GCV15.7μM 1 0％ 98.2±5.5 2 5％ 92.6±10.9 3 10％ 71.0±9.0 a 4 20％ 57.3±5.2 b 5 40％ 48.8±7.0 b 6 60％ 31.0±3.5 b 25.9±4.6 b 7 100％ aP 0.05, bP 0.01,与组1比较

65 (一)六味地黄丸药物血清联合不同比例tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞的作用观察

66 The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 5%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h) 血清（%） GCV GCV %tk/GCV (0μM) (39.2μM) (39.2μM) 对照 对照 对照 含药 含药 含药 Q值 5 7.5 100.00± ± ±1.71 122.04± ± ±6.86 128.79± ± ±28.12 a 128.06± ± ±9.85 120.06± ± ±13.71 a 1.19 1.12 (mean±SD n=3)

67 The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h) 血清（%） GCV GCV %tk/GCV (0μM) (39.2μM) (39.2μM) 对照 对照 对照 含药 含药 含药 Q值 5 7.5 100.00±15.63c ±6.37ac ±8.48b 89.06±12.85c ±12.55c ±16.17b 91.06±9.69c ±6.25c ±13.06abd 97.45±12.60c ±8.34cb ±11.99b 92.77±11.11c ±1.87db ±8.45bd 1.23 1.73 (mean±SD n=6)

68 10%tk/GCV，7.5%对照血清孵育12h 10%tk/GCV，7.5%含药血清孵育12h

69 The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)（Serum:24h） 血清（%） GCV GCV %tk/GCV (0μM) (39.2μM) (39.2μM) 对照 对照 对照 含药 含药 含药 Q值 5 7.5 100.00± ± ±8.78 77.13± ± ±3.11 a 113.66± ± ±16.66 a 94.07± ± ±11.61 a 90.47± ± ±17.79 a 1.04 1.26 (mean±SD n=3)

70 The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 20%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay)(Serum:12h) 血清（%） GCV GCV %tk/GCV (0μM) (39.2μM) (39.2μM) 对照 对照 对照 含药 含药 含药 Q值 5 7.5 100.00± ± ±11.83 67.26± ± ±3.84 83.29± ± ±4.54 a 81.73± ± ±5.87 96.40± ± ±8.43 1.02 0.82 (mean±SD n=3)

71 The effect of herbs serum of Liuwei Diduang Bolus combining with 10%tk/GCV system on CBRH7919(MTT assay: dose-effect relationship)(Serum:12h) 血清（%） GCV GCV %tk/GCV (0μM) (39.2μM) (39.2μM) Q值 5 10 100.00± ± ±11.41 105.05± ± ±4..62b 106.44± ± ±2.33ac 1.16 1.49 (mean±SD n=6)

72 六味地黄丸含药血清联合10%tk/GCV系统对肝癌细胞生长的影响作用（MTT法;量效关系）

73 六味地黄丸药物血清联合不同比例tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞的作用观察实验小结
通过以上实验, 七天血清:六味地黄丸含药血清联合10%tk/GCV系统的协同杀伤作用效果较好;血清孵育12h是药效较好的时间点;四天血清:协同杀伤作用呈现剂量依赖性,随血清浓度升高协同作用增强(P<0.01)

74 （二）中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选
对丹参注射液（含水溶性混合成分）、苦参碱、三七总皂甙、芹黄素、白藜芦醇、姜黄素、丹参素、小檗碱、苦参碱、大黄素、木犀草素、黄芩苷、山奈素、枸杞多糖等进行了筛选实验。

75 肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作

76 重组质粒的构建方案 质粒pTKGFP构建流程图 EcoR I Xma I EcoR I- EcoR / BmH EcoR / Xma
tk cDNA Xma I gfp cDNA EcoR I Xma tk cDNA(无终止密码) Xma I EcoR I- 质粒pTKGFP构建流程图

77 B16/pTKGFP (tk+) B16/pEGFP-N1 B16/pDsRed2-N1 (tk-) (tk-)

78 合作者 李杰芬　　　谭宇蕙 　吴映雅 易 华　 杨巧红　　　　赵 鹏 王惠峰　　　袁 静 　宁异真 张爱娟

79 谢谢！