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枸杞LycE基因的克隆及功能验证 报告人：刁进进 导 师：季静 教授 王罡 教授
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研究背景 类胡萝卜素是动物生长发育过程中得必要物质，植物能自身合成，但动物必须从食物中获取。不同类胡萝卜素的生物学功能也不相同，β-胡萝卜素与含有β-环的胡萝卜素（如-胡萝卜素、-隐黄质和-胡萝卜素）是动物和人体内维生素A的合成前体物质，维生素A对机体的生长发育和新陈代谢有重要的作用，使机体保持着健康的状态。维生素A缺乏（VAD）是全球性公共卫生，在很多的非洲国家非常严重，主要是由于主食如玉米、水稻和小麦中的维生素A原的含量非常低，目前全球有78个国家存在着维生素A缺乏的公共卫生问题，共计人数超过2.5亿人，VAD病患者免疫系统薄弱，常伴有夜盲症、角膜瘢痕等疾病，大大增加了婴儿的传染病发病率和死亡率，加重病情，每年约有100万儿童的死亡是由VAD引起，学龄前儿童和孕妇是VAD的高危人群。 基于这样的现状，如果我们能克隆类胡萝卜代谢途径中的关键酶基因，并把这些基因转入到玉米或者水稻等作物中，使之在作物中过量表达，从而直接提高类胡萝素含量，使人们远离VAD的困扰。
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类胡萝卜代谢途径
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前沿 类胡萝卜素是C40的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素（carotenes）和它们的氧化衍生物叶黄素（xanthophylls）两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB（pds）和crtI基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体：β-胡萝卜素。 番茄红素的环化反应是是植物体内胡萝卜素生物合成途径重要的分支点。番茄红素ε-环化酶(Lycopene ε-cyclase, LycE)，能催化番茄红素的一端形成δ-环，生成δ-胡萝卜素。 随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。
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类胡萝素代谢途径研究进展 PSY LycB 上游基因研究进展：
psy是类胡萝卜素代谢途径的关键酶基因，也是限速酶基因，zhang等将橙子中的psy基因转入到金橘中，类胡萝卜素含量增加了1.6倍，-胡萝卜素含量增加了2.5倍。 LycB LycB基因也是类胡萝卜素代谢途径中非常重要的一个关键酶基因。2004年，Kato等研究发现，柑橘果实成熟时，LycB基因的表达增强，果实中的堇菜黄质和玉米黄质含量增加。最显著的成就是D′Ambrosio等，以35S为启动子，将西红柿中的LyB基因的cDNA转入到HC西红柿中，发现所有的番茄红素全都转化为-胡萝卜素
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下游基因研究进展 类胡萝卜素合成代谢的下游主要指-胡萝卜素和-胡萝卜素的代谢，主要的酶是一系列羟化酶和氧化酶。 对下游基因单独研究非常少，基本集中在多基因的研究上。将土豆中bch基因沉默，发现总的类胡萝卜素含量减少，但-胡萝卜素含量却增加。 2010年，Ji等将羟化酶基因CYP97A，CYP97B，CYP97C和AtB1，与酮化酶基因bkt1基因转入到拟南芥中，设计实验，首先分别单独将4个基因转入到拟南芥中，鉴定基因的功能，然后btk1基因分别于每个羟化酶基因共同转化到拟南芥中，分析实验结果。他们的研究，证明CYP97B是-胡萝卜素环的羟化酶，过量表达羟化酶基因和酮化酶基因并不能使植物体内积累含有酮基的类胡萝卜素，而植物体内的-胡萝卜素衍生物的含量提高，同时-胡萝卜素含量减少。这可能是因为酮化酶和羟化酶共同作用时，影响着它们进入不同的代谢途径。
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本研究的目的和意义 目的 意义 从枸杞中克隆出类胡萝卜素代谢途径中关键酶LycE基因，并在体外验证其活性
分离得到一种新的番茄红色环化酶基因，为类胡萝素基因工程的研究打下基础
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实验技术路线
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实验结果 枸杞总RNA的提取
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cDNA的合成
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Box Shadow Boxshade分析
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进化树
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蛋白质三维结构
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携带目的基因的克隆载体pMD18-T-LcLYCE的构建
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推测氨基酸序列
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LcLYCE基因编码的蛋白特性 枸杞LcLYCE基因的cDNA全长1847bp，包含一个1569bp的开放阅读框，编码523个氨基酸，其基因编码蛋白的分子式为：C2632H4135N699O751S29。预测蛋白的分子量和等电点分别为58.52kDa和7.783。氨基酸组成分析表明，该蛋白亮氨酸含量最高，56个亮氨酸占总氨基酸的10.7%。由523个氨基酸组成的多肽链包含58个强碱性氨基酸，56个强酸性氨基酸，195个疏水性氨基酸和125个极性氨基酸。信号肽预测表明，LcLYCE蛋白的氨基端存在44个氨基酸的信号肽。通过细胞定位分析软件可知，该蛋白大部分为膜蛋白，少部分存在于叶绿体中。 通过PredictProtein预测蛋白二级的结构，结果显示，无规则卷曲占LcLYCE蛋白二级结构的46.85%，α-螺旋占36.9%，延伸链占16.25%。多序列比对显示，该蛋白的大部分氨基酸序列在植物中高度保守 与NCBI数据库中已报道的其它物种LYCE蛋白序列进行BLASTP分析显示， LcLYCE蛋白的氨基酸序列与烟草NtLYCE氨基酸有94%的同源性，与马铃薯StLYCE氨基酸有93%的相似性，与番茄SlLYCE氨基酸有92%的相似性，与葡萄VvLYCE氨基酸序列有77%的同源性，与拟南芥AtLYCE氨基酸有72%的同源性。由系统发生树可知，LYCE蛋白与烟草，番茄等茄科植物属于公共的发生簇，有最近的进化关系
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大肠杆菌表达载体pET-28a-LcLYCE的构建
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SDS-PAGE
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颜色互补
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烟草表达载体pCAMBIA2300-LYCE
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烟草转基因
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转基因烟草的检测
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半定量
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Southern杂交
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在烟草中的表达结果
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RT-PCR
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谢谢大家
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