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培養於不同培養基的樟芝及其抗氧化粉之研究
指導老師:蕭明謙 報告人:吳宜軒、吳啟瑋
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研究動機 樟芝具有十分廣泛的生物活性，如保肝、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、解毒、抗炎等功效，有很好的藥用價值，是一種極具開發潛力和應用前景的藥用真菌，近年來成為國內外研究和開發的熱點。 生理活性成份例如：三萜成份、菌絲多醣體及甲醇萃出物之研究。而目前分離鑑定出的三萜類已經超過百種，其可抗癌細胞生長，活化神經細胞生長能力等生理活性，對肝腫瘤細胞有毒殺性作用，且可抗發炎、抗過敏及降膽固醇作用，也可降血壓進而預防中風，因此樟芝的價格居高不下。
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研究目的 主要針對樟芝為原料，研究不同培養基及培養方式對樟芝生長之影響，並研究其抗氧化能力，進一步萃取有效成分，並評估萃取液之總多酚類含量、DPPH 自由基捕捉能力及抗氧化能力，了解總多酚化合物的含量和抗氧化能力的關係。希望藉本研究來評估不同培養方式對牛樟芝有效成分之影響。
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研究流程 分析不同樟芝培養基之抗氧化能力 分析不同培養基對樟芝生長之影響 利用不同培養基培養之樟芝抗氧化能力之分析
找出最佳培養基與樟芝子實體、菌絲體圖譜比較
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樟芝簡介 樟芝又稱牛樟芝或牛樟菇，屬於非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌類，樟芝氣味芳香，味辛、苦。樟芝子實體有強烈的樟香味，長於牛樟樹洞中。外觀、氣味、生長速度、孢子顯微結構，紅色面有許多細孔，內有孢子，味極苦。因其具有排毒、清血、解毒保肝、補腎強心、健胃整腸、鎮痛抗菌、強化免疫去過敏、消除腫瘤抗癌症等神奇功效，素有『靈芝之王』、『藥中之王』、『台灣森林中之紅寶石』的美譽。
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樟芝子實體、菌絲體簡介 樟芝子實體為多年生，無柄之真菌類，具有強烈的黃樟香氣味，初為扁平型，貼生於樹幹表面，之後其前緣會略為捲曲翹起，外形呈板塊狀（層紋板狀）或像鐘乳石狀，曬乾後褪色成土黃白色，味極苦。民間視樟芝為解毒、保肝、抗癌之草藥，原住民更將樟芝奉為上品，不僅家中常備，出外時更是隨身攜帶。 樟芝菌絲體的水萃取物可保護紅血球減少溶血現象，且隨水萃取物的濃度加高保護效能更好；並能減少人類臍帶血管內皮細胞上，因自由基所造成的膜蛋白改變。
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樟芝菌絲體、子實體其生理活性 以菌絲體和子實體抗氧化能力比較中，在研究報告中分別以甲醇萃取物進行分析，抗氧化力、脂質過氧化物的抑制、自由基(DPPH‧)的捕捉及鐵離子的還原能力，不論是新鮮或風乾子實體均優於菌絲體；而自由基(‧O2－, ‧OH)的捕捉能力方面，菌絲體是介於新鮮或風乾子實體之間；螯合亞鐵離子以菌絲體最好。
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樟芝成分分析 樟芝的生理成份有多醣體（polysaccharides）、三萜類化合物（triterpenoids） 、超氧歧化酶（superoxide dismutase）、腺苷（adenosine）、蛋白質、維生素、菸鹼酸、麥角固醇（ergosterol）、微量元素（如鈣、磷、鍺）、核酸、氨基酸、固醇類（steroids）、木質素（lignin）、血壓穩定物質（如antrodia acid）、酚類（phenolic content）等。
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樟芝培養 樟芝培養分為固態與液態之培養: (一)固態培養~ 利用樟芝固體栽培，以三萜類為評估培養基配方及培養條件的依據，其乃利用特殊培養基配方組成，經高溫高壓滅菌冷卻之後，將菌種移入培養，再以適當的環境條件控制，令其生長速度加快，並可誘使樟芝菌種在洋菜培養基上行子實體的發育生長。利用此特殊培養基的組成加以修正後，以固體人工栽培方式加以培養，經過兩個半月之後便可以形成與野生狀態相近的生長狀態。
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(二)液態培養~ 在搖瓶培養階段裡，溫度控制在25℃，起始pH5. 0，轉速100 rpm 的環境條件中，可以在第14天收得菌絲體量為486
(二)液態培養~ 在搖瓶培養階段裡，溫度控制在25℃，起始pH5.0，轉速100 rpm 的環境條件中，可以在第14天收得菌絲體量為486.8mg/100 ml，但高轉速並不適合菌絲體的生長，最適轉速是100 rpm。
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抗氧化功能測定 抗氧化物質在化學結構上具有清除自由基、提供電子及氫原子，使其具有清除DPPH自由基、抗氧化能力等功能性。目前對於抗氧化評估方法隨著科學技術的發展和設備的更新而不斷的發展和改變。 以下是一些常見的抗氧化活性評估的方式: DPPH自由基捕捉能力 總酚含量測定 抗氧化能力測定
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實驗材料 1.樟芝子實體 9.三氯醋酸 2.地瓜 10.乙醇 3.粉薯 11.沒食子酸 4.薑黃(分為烘焙、水蒸) 12.DPPH 5.PDA 13.Ferrozine 6.PDB 14.Folin試劑 7.亞麻油酸 15.Na2CO3 8.磷酸鹽緩衝液(pH6.6)
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實驗儀器 1.分光光度計(UV): 量測範圍為 nm，以氘燈、鎢鹵燈為燈源。 2.滅菌釜: 直立式高壓滅菌釜，操作溫度121 ℃，30分鐘。 3.恆溫培養箱: 0~250 rpm，操作溫度25℃，150 rpm。 4.超音波振盪器: 30 L 600W 40Hz。 5.HPLC高效能液相層析儀: 幫浦、自動注射器、檢測器型號: series 200。
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HPLC高效能液相層析儀 (型號:series 200)
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實驗方法及步驟 不同固態培養基對樟芝菌絲生長之影響 不同植物培養基對樟芝生長之影響 樟芝菌絲體培養 樟芝抗氧化成分萃取
植物抗氧化能力測定 a.清除DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)自由基能力測定 b.總酚含量測定 c.抗氧化能力測定 HPLC全成分分析
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結果與討論(一) 1.樟芝生長於不同植物上之菌絲體其抗氧化能力，與地瓜相比，樟芝生長於地瓜後可達16.39 mg/g，DPPH捕捉能力提高至94.5 %，抗氧化能力為0.19A。所以利用地瓜作為樟芝培養基，所培養出的樟芝菌絲體其抗氧化能力可與野生樟芝子實體相當。 2.添加地瓜、粉薯及薑黃至PDA培養基中，發現能促進樟芝生長，除了薑黃+PDA培養基因本身培養基顏色偏黃，因此樟芝菌絲體的顏色較不明顯，有添加植物培養基的PDA，可看出菌絲體其顏色與厚度皆優於PDA培養基，因此添加植物培養基可能可有效刺激樟芝菌絲體的生長。
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不同培養基對牛樟芝菌絲體生長之影響 a:水蒸 b:烘焙
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不同植物培養之牛樟芝抗氧化能力
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結果與討論(二) 3.測定樟芝子實體與菌絲體之總酚含量、DPPH捕捉能力、抗氧化能力，研究發現樟芝菌絲體的總酚含量僅有2.5mg/g，而子實體可達16.7mg/g，因此發現利用地瓜作為樟芝培養基，所培養出樟芝菌絲體其抗氧化能力可與野生子實體相當。
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樟芝子實體與菌絲體之抗氧化能力
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樟芝子實體乙醇萃取液HPLC分析圖譜
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樟芝菌絲體乙醇萃取液HPLC分析圖譜
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生長在地瓜上的樟芝之乙醇萃取液HPLC分析圖譜
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結論 樟芝含有豐富三萜類及抗氧化成分，而三萜類一般都是子實體的含量較高，本研究則探討子實體、菌絲體及利用不同培養基培養之樟芝其抗氧化能力，利用地瓜、粉薯、薑黃作為培養基，並探討樟芝對於不同培養基的生長影響，並比較子實體、菌絲體及不同培養方式所生長的樟芝菌絲體其DPPH自由基捕捉能力、總酚含量及抗氧化能力來判斷其抗氧化能力。對於其抗氧化能力最佳者做HPLC的定性分析，並比對其成分。
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參考文獻 林志遠，牛樟芝子實體形成之探討。國立東華大學生物技術研究所碩士論文(2005)
Ames B. N., (1983) Dietary carcinogens and anticarcinogens: oxygen radicals and degenerative diseases. Science, 221: Ames B. N., Shigenaga M. K., and Hagen T. M., (1993) Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Nat. Chang T. T. and Chou W. N., (1995) Antrodia cinnamomea sp. nov, on Cinnamomum kanehirai in Taiwan. Mycol. Res. 99: Deiezak J. D., (1986) Preservatives: Antioxidants- The Ultimate Answer to Oxidation. Food Technology, 40: 9-34. Gey K. F., (1990) The antioxidant hypothesis of cardiovascular disease: epidemiology and mechanisms. Biochemical Society Transactions, 18: 林志遠，牛樟芝子實體形成之探討。國立東華大學生物技術研究所碩士論文(2005) 高曉薇，台灣靈芝屬新種樟芝三萜類成份研究。台北醫學院天然物醫學研究所碩士論文（1991）。 張曉莉，樟芝子實體、菌絲體及相關產品三帖類差異之探討 (2002)。 楊惠茹，牛樟芝子實體抽出物抗疲勞功能之評估，國立體育大學(2011)。 陳如茵，楊筱姿，蔡美珠，林欣榜，梅 (Prunus mume Seibu. Et Zucc.) 之花及不同成熟度果實水萃物抗氧化性及苦杏仁苷含量 之探討。台灣農業化學與食品科學 (2006)，44： 。
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報告結束 多謝聆聽
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