微生物工程 实验.

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1 微生物工程 实验

2 课程简介： 本实验课程可面向全校生物技术相关专业本科生，共有学时数20学时，实验教学内容包括：“产酶微生物的分离与筛选”、“发酵罐的操作演示”等。实验教学中包括演示型、技能型和设计型实验环节，全面提高学生的实际操作能力、综合设计能力和应用能力。

3 目 录 实验一 产酶微生物的分离与筛选(操作性) 4学时 实验二 黑曲霉产木聚糖酶液态发酵的工艺优化(设计性)
目 录 实验一 产酶微生物的分离与筛选(操作性) 4学时 实验二 黑曲霉产木聚糖酶液态发酵的工艺优化(设计性) 实验三 发酵罐的演示使用(操作性) 实验四 酸奶的制作(操作性) 实验五 米酒的酿制(操作性)

4 实验一 产酶微生物的筛选 【实验目的】 【实验原理】
实验一 产酶微生物的筛选 【实验目的】 通过本实验的学习，使学生具备能通过查阅资料自己单独设计实验方案，从自然界中筛选出所需的发酵微生物的能力。 【实验原理】 同学们根据自己选择的实验题目，查阅资料得到的信息，自己列出筛选原理。

5 【实验步骤】 1.同学们从淀粉酶产生菌的筛选”、“蛋白酶产生菌的筛选” 这两个个实验题目中任选一个 ，通过查阅资料，列出实验方案，实验方案包括如下内容： 如何取样 筛选培养基的组成 如何判断平板上的菌株是所筛的微生物 所需的试剂材料清单

6 【实验步骤】 2.老师和学生共同讨论同学们交上来的实验方案，并根据实 验室的具体情况来讨论实验方案的可行性。
3.老师根据共同讨论后确定的实验方案，为学生们准备好 所需试剂仪器。 4.同学们单独完成实验，如个别同学实验失败，需重新设计方案，再在空余时间完成实验，知道实验成功为止。

7 实验二 黑曲霉产木聚糖酶液态发酵工艺的优化
实验二 黑曲霉产木聚糖酶液态发酵工艺的优化 【实验目的】 学习用正交设计的方法进行发酵工艺的优化 【实验原理】 发酵培养基的优化一般可通过下面的步骤进行。根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

8 【实验步骤】 1.同学们根据实验指导书上提供的因素水平表，设计4因
素3水平的正交实验；并根据正交实验安排，全班分9各组，每个组做一个实验号。 2.每个组同学，根据正交实验安排表所对应的试验号的因素水平，配制培养基，培养基灭菌冷却后接入一环 黑曲霉孢子，于30℃、150转/分钟下培养3天 3.发酵结束后，用纱布过滤，收集发酵液，并测定发酵 液的木聚糖酶酶活

9 【实验步骤】 4.木聚糖酶酶活测定 （1）酶活定义
以木聚糖为底物，在40 ℃，pH4.6的条件下，每小时酶解产生1mg木糖定义为一个酶活力单位，单位为u/mL。 （2）标准曲线的制作 分别吸取木糖标准液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL，依次加入7支50 mL比色管中，以蒸馏水补加到2.00 mL，再各加入DNS试剂1.50 mL，在沸水中煮5分钟，冷水冷却后，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，在540 nm处，用空白管溶液调零点，记录其吸光度值。以木糖的质量和相对应的吸光值计算回归方程。

10 （3）酶活测定 将稀释好待测酶液加1mL于25 mL比色管中，然后放入40℃的恒温水浴锅中保温5分钟，加入 1 mL木聚糖溶液，保温30分钟，使酶与底物充分反应，之后加入 1.5 mL DNS试剂中止反应。对照管先加1 mL待测酶液，再加1.5 mLDNS，摇匀，使酶液失活，然后再加1 mL木聚糖溶液，同上面的一起迅速放入沸水中水浴 5分钟进行显色反应，取出后，用蒸馏水定容到25 mL，充分混匀后于分光光度计上在540nm处测定其吸光值。并计算酶活大小。 4. 全班9组同学把每组实验结果汇总，并根据汇总的结 果，进行正交实验分析，确定培养基最佳配方

11 实验三 发酵罐的演示使用 【实验目的】 【实验原理】 了解小型玻璃罐的构造以及其使用方法。
实验三 发酵罐的演示使用 【实验目的】 了解小型玻璃罐的构造以及其使用方法。 【实验原理】 好氧发系统由辅助设备和发酵罐组成。辅助系统包括蒸汽发生器、压缩机、空气过滤器等组成。蒸汽发生器是用来产生高温蒸汽对发酵设备进行灭菌的；压缩机和空气过滤器是用来产生有一定压强的无菌空气的。发酵罐主要由罐体、电极、控制系统等组成。

12 【实验步骤】 1.发酵罐的基本结构的认识

13 1 电加热器 9 灭菌罩 17 测温电极（3） AQ 安全阀 2 测温电极（1） 10 进气过滤器 18 尾气过滤器 W1 溢水阀 3 水位电极 11 DO电极 19 尾气滤水器 W2 排水排汽阀 4 补料瓶 12 测温电极（2） 20 取样放料装置 S 进蒸汽阀 5 呼吸过滤器 13 泡沫电极 21 罐盖 EW 冷却水电磁阀 6 补料蠕动泵 14 PH电极 22 回水管 G 气路调节阀 7 气体稳压阀 15 快速接头 23 恒温水槽 P1P2 压力表 8 进气流量计 16 排气冷凝器 24 液位电极

14 2.发酵罐的灭菌及使用方法 （1）培养基配制 培养基的体积通常为罐容积的50％～60％。准确称量培养基各组分，溶解后放入发酵罐。 （2）实罐灭菌 第一步 装上已校正好的PH、DO电极并旋上保护盖（或者用牛 皮纸包扎也可以），以防止灭菌时电极被蒸汽弄潮而损坏。 第二步 按工艺要求在罐内放入发酵培养液。 第三步 将密封固定架安装于轴套上，将瓶架安装于密封固定架 上，将4—补料瓶、19—尾气过滤瓶安装固定在瓶架上。

15 第四步 将进气口、取样口、补料口各胶管弯曲夹紧。注意：尾气 口必须敞开。 第五步 盖上灭菌罩，拧紧固定螺丝，插上17—测温电极(3)的插头。 第六步 打开面板控制开关，选择灭菌辅助程序，设置灭菌温度 STEMP(105~130℃)与灭菌时间STIME，将搅拌转速设置为 0rpm，将中间温度MTIME设置为0℃，并进入程序运行 。注意：此时仪器的电源总开关应为关闭状态。 第七步 提供蒸汽源，打开S—进蒸汽阀，打开W2-排水排气阀，让 蒸气不断进入罐内，使罐体温度不断升高。当灭菌罩温度 和恒温槽温度升至100℃左右后，逐渐关小W2，使温度继 续上升，直到升到所需温度（注意对应压力）。当温度达 到设定的灭菌温度时，计时开始。这时应不断调节S和W2 使得温度稳定在设置温度上。操作时应密切注意灭菌罩上 的压力表指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过 0.2Mpa，温度不超过130℃。

16 第八步 当设定的灭菌时间到时，仪器发出鸣叫报警，此时将蒸汽源关闭，将S阀关闭，W2微开，让罐体自然冷却。 第九步 当罐内温度降到50℃以下，罐内压力达到常压状态时，小心取下灭菌罩，将W2-排水排汽阀关闭，实消完成。实消完成后，应尽快通入空气，保证罐内不处于负压状态。

17 （3）开车运行准备工作 第一步 安装上22—回水管堵头，关闭W2-排水排汽阀，打开W1—溢流水阀，打开冷却水源。 第二步 关闭G—气路调节阀，连接空气压缩机与发酵罐的进气 端。 第三步 打开空压机，检查空压机出口端、7—减压除水过滤器 的压力，将压力调整至 MPa。注意：发酵罐内 空气压力必须小于0.1MPa。当发现压力难以调整时， 应关闭7—减压除水过滤器，将G—气路调节阀打开， 然后重新进行调整。 第四步 将10—进气过滤器与P1—压力表用硅胶管连接。 第五步 先打开G—气路调节阀，然后松开进气、尾气口胶管夹 头，将气量调节至工艺所需的流量。注意：必须检查 10—进气过滤器、18—尾气过滤器、19—尾气过滤瓶 及气路是否堵塞。玻璃罐内压力必须小于0.1Mpa。

18 第六步 安装好搅拌电机和顶盖接地线。 第七步 插入12—测温电极(2)。 第八步 取下DO、PH电极上的保护盖或防护牛皮纸。 第九步 连接11-DO电极、12—测温电极(2)、13—泡沫电极、14-PH电极和电机的插头。 第十一步 将补料瓶的输液胶管安装在对应蠕动泵上，然后 松开补料口胶管夹头。注意：蠕动泵运转方向与 胶管安装方向。 第十二步 在非运行（即非RUN）状态下，打开总电源开关。 设置较低的罐体温度，进入RUN，使罐体温度较 快下降。

19 （4）接种 在接种口周围放置浸有酒精的棉花，点燃后，在火焰中加入种子液，通常接种量为发酵培养基体积的1％～5％。拧紧接种口后，调节搅拌速度，开始培养发酵液。 （5）发酵结束 发酵结束后，取出发酵液和各种电极，清洗发酵罐。

20 3. 发酵罐发酵过程对咯参数的控制

21 实验四 酸奶的制作 【实验目的】 【实验原理】 了解厌氧发酵的发酵方式，掌握酸奶的制作过程。
实验四 酸奶的制作 【实验目的】 了解厌氧发酵的发酵方式，掌握酸奶的制作过程。 【实验原理】 酸奶是以牛乳等为原料，经乳酸菌发酵生产的一种具有较高营养价值和特殊风味的饮料，并可作为具有一定治疗的食品。其制作原理是通过乳酸菌发酵产酸，是牛乳中酪蛋白凝固，同时，形成酸奶独特的香味（与乙醛生成有关）。

22 【实验步骤】 将发酵培养基煮沸灭菌，冷却到43℃时接入3％发酵菌种，放入到43℃恒温培养箱中。发酵培养4～6 h，至牛乳凝固即可。发酵结束后，对所制的酸奶进行感官分析

23 【质量评价】 1.感官指标 2.理化指标 3.微生物指标 乳酸菌群≧1×106cfu/mL 4.评价方法
呈均匀一致的乳白或淡黄色；具有酸乳固有的滋味和气味；组织细腻、均匀，允许有少量的乳清析出。 2.理化指标 全脂纯酸乳脂肪 ≧ 3.0%，蛋白质≧2.9%，非脂乳固体8.1%，酸度≧ 70。T。 3.微生物指标 乳酸菌群≧1×106cfu/mL 4.评价方法 按照GB 《酸牛乳卫生标准》进行评价。

24 【思考题】 1、酸乳加工中对原料有什么要求? 2、使用混合乳酸菌发酵剂在酸乳制作中有何优点? 3、酸乳饮料在生产过程中应如何避免出现沉淀？

25 实验五 米酒的制作 【实验目的】 【实验原理】 学习米酒的酿制方法
实验五 米酒的制作 【实验目的】 学习米酒的酿制方法 【实验原理】 煮熟的米饭经接种酒曲后，在适宜的培养条件下让种曲中根霉孢子萌发成菌丝体；经大量繁殖后通过淀粉酶和糖化酶的作用将淀粉转化成葡萄糖，此为根霉的糖化阶段。然后再由根霉或种曲中的酵母菌继续将糖化后的部分葡萄糖转化成乙醇。生料酒曲中的生淀粉糖化酶将大米中的淀粉在酶解成葡萄糖，然后酒曲中的酵母将葡萄糖转化成乙醇。

26 【实验步骤】 1.米酒的熟料酿制 （1）淘洗和浸泡 将100g大米淘洗后浸泡过夜，使米粒充分吸水，以利蒸煮时米粒分散和熟透均匀。
（2）蒸煮米饭 将浸泡吸足水分的大米捞起，放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮，至米饭完全熟透时为止。 （3）米饭降温 将蒸熟的米饭从锅内取出，在室温内冷却接种。 （4）接入种曲

27 （5）固态糖化 接种匀拌后的米饭可装三角瓶发酵。所用容器都应预先洗净，并用开水浇淋浸泡过，以杀死大部分细菌。温度可控制在30℃左右，发酵初期可见米饭表面产生大量纵横交错的菌丝体，同时米饭的黏度逐渐下降，糖化液渐渐溢出和增多。

28 （6）液态发酵 固态糖化20 h～24 h，三角瓶底有糖化液出现时可加入水，加入的水量为大米的1.3～1.4，加水后密封瓶口。发酵时间一般控制7d。 （7）蒸馏 将100g大米的酒醅移至500mL蒸馏烧瓶中，加水100mL，蒸出100mL酒液。用酒度计测酒精度，并对所酿造的酒进行感官分析。

29 2.米酒的生料酿造 将100g大米洗净后加入到500mL三角瓶中，加入250mL自来水，加入0.8g生料酒曲，密封瓶口，于30℃恒温培养箱中发酵10天。发酵结束后用纱布过滤收集发酵液，并将其移至500mL蒸馏烧瓶中，加水100mL，蒸出100mL酒液。用酒度计测酒精度，并对所酿造的米酒进行感官分析。