研究法 細胞學實驗 學生 黃怡鈞.

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1 研究法 細胞學實驗 學生 黃怡鈞

2 無菌操作 1.研究人員視需求及實驗性質不同選擇適當之無菌操作台 2.無菌室非使用期間照射UV燈 3.無菌操作台使用前以UV燈照射半小時
4.在操作台內打開(蓋上)器皿為了避免污染均要過火滅菌 (瓶口) ，並且避免蓋口朝上暴露於空氣中過久，手勿通過開 蓋之器皿上方，吸管前端或容器口保持清潔不碰觸物品 5.物品進入操作台前必須以棉花沾酒精擦拭滅菌 6.使用完無菌操作台後必須以酒精棉擦拭檯面並且攜出實驗 物品，並帶走廢棄物收集統一滅菌

3 7. 實驗時小心操作避免實驗物或藥品灑出並注意桌面整潔
8. 酒精燈使用小心，物品噴灑之酒精未乾前勿過火滅菌， 以免造成危險。 9. 燈中酒精量若只剩1/3 時請添加酒精，熄火後將酒精燈 靜置超過三分鐘，再將酒精燈移至實驗桌上添加，勿在操 作台上添加；勿將酒精裝滿，約裝2/3 滿即可 。 10. 培養箱需注意清潔更換水盤(無菌水 並添加消毒水) 11.定期更換無菌操作台之HEPA過濾膜 12.進行無菌實驗操作者實驗前後洗淨雙手，在進入無菌台 前亦要以棉花沾酒精擦拭，並穿著實驗衣及戴手套 保護自己安全。

4 無菌操作組織培養基本設備 無菌操作台:

5 二氧化碳培養箱:

6 滅菌設備:

7 實驗室生物安全等級 1.一級實驗室: 最基本的安全防護措施。處理已定性不引發 疾病之活微生物
1.一級實驗室: 最基本的安全防護措施。處理已定性不引發 疾病之活微生物 2.二級實驗室: 中等風險微生物操作人們穿著實驗衣手套 生物安全操作櫃及一般物理防護設備 3.三級實驗室: 進行較為危險致命感染性(氣體)微生物操作 必須在生物安全櫃中或密閉設備中進行實驗 實驗室進出管制及獨立排氣系統 4.四級實驗室: 獨立建築物或有排氣廢棄物處理系統可防止 微生物外洩之單獨隔離區，穿著全身防護衣 進行高危險致命性微生物實驗(配有三級之 生物反應櫃)

8 實驗室生物安全等級 生物安全等級一： 1.適用於使用之生物不會使健康人致病、對實驗室工作人員及環境具最低潛在危險。
只能處理已經被定性，對健康成人不引起發病的活微生物 (非致病菌) 2.工作可依照標準微生物操作準則，在開放的實驗桌上進行，不需特殊設計的污染防護儀器設施。 3.實驗室無須與其他作業區域分離。一般而言，實驗室工作人員，必須接受實驗操作的特別訓練，並由具備微生物(或相關知識)使用須知訓練的實驗室主管或有相關經驗者所管理。

9 生物安全等級二： 1.用於中度潛在危險的病原。病原與人類疾病有關，可能有皮膚接觸、誤食及黏膜暴露。如：金黃色葡萄球菌。 承擔的風險為可能經皮膚、黏膜引起危險的微生物 (等級二以上均為致病菌之處理) 2.與等級一差別在(1)實驗室工作人員受過使用致病物質的特殊訓練並由適當的專家所指導。(2)工作進行中需管制門禁。(3)特別小心受污染的尖銳物品。(4)操作步驟可能產生氣霧或濺灑者，需使用生物安全操作櫃或物理性防護設備。

10 生物安全等級三： 1.可經氣膠傳播之本土或外來病原，會嚴重危害健康。 承擔的風險為可能由空氣傳播感染的微生物 (具有高度傳染性但致死率不高或低傳染性但致死率高) 2.適用於臨床、診斷、教學、研究單位、工作人員必須接受處理致病性及致命生物的特別訓練，並由具經驗之專家監督管理，處理感染性物質的過程需在生物安全櫃中進行，或使用其他物理防範裝置，或工作人員穿配保護性衣著與裝置。實驗室需經特殊設計(如緩衝區、密封通道、定向氣流等)。故需遵守標準微生物操作、特殊操作及安全設備規範才能符合等級三之需要。 3.與第二級差在(1)生物安全櫃中或密閉設備中進行實 驗(2)進出實驗室嚴格管制(3)有獨立的排氣系統降低空染 之危險性

11 生物安全等級四： 1.適用於可經由氣膠傳播或未知傳染危險之危險生物病原，會引起對生命之高度危機的疾病。如：依波拉病毒。　 實驗室可進行海外來的或不知名微生物會引起個人高風 險對生命具有危險性的目前無藥物或疫苗可用之微生物 (具有高度傳染率與致死率的病原) 2.實驗工作人員必須接受極度危險之感染性物質的特別訓練，需充分了解標準及特殊操作、設備、實驗室的設計特色。並嚴格管制實驗室門禁，所有活動皆限於第三級生物安全櫃中；或於第二級生物安全櫃中，工作人員穿著連身式具支持生命系統通風設備的正壓工作服。實驗室具特殊設計可有效防止微生物散佈至環境中。實驗室設於不同棟或同棟建築內的管制區域，完全與其他區域隔離。 3.與三級實驗室不同在於(1)通常是單獨隔離區具有排氣及 廢水處理系統(2)三級生物操作櫃進行實驗(3)穿著全身、 正壓供氣性個人防護服(4)新建獨棟設計規劃

12 生物安全櫃分級 第一級: 主要在保護人員及環境但不提供對櫃內操作物之潔 淨保護。排氣口有HEPA過濾以避免環境汙染。
第一級: 主要在保護人員及環境但不提供對櫃內操作物之潔 淨保護。排氣口有HEPA過濾以避免環境汙染。 由於無法提供櫃內操作物種的潔淨保護 目前各生技相關產業中第一級安全櫃的使用已逐漸 減少 第二級: 可提供櫃內實驗物之潔淨與保護，其防護原理是以 櫃內氣流配合HEPA使用來提供無菌操作環境，此 級安全櫃可提供人員環境實驗物三層保護。 第三級: 使用時機在於操作生物安全第四級之微生物(試劑) 通常安裝於防護嚴格之污染控制實驗室，此安全櫃 實驗操作則利用密封之橡膠手套進行以避免使用者 直接接觸危險物。

13 生物安全櫃分級 第一級安全櫃: 1.第一級安全櫃結構設計如圖1 所示，其使用目的在於保護人員及環境，但並不提供對櫃內操作物種（實驗試料、產品等）的潔淨保護。 2.櫃體在排氣口處設有HEPA FILTER，以避免安全櫃內操 作物質未經處理排出後污染環境。而在操作人員保護方面， 生物安全櫃主要是藉櫃體內的氣體流場來進行操作物與人員 的隔離，因此在操作區需保持最小的送風速度至少應達到 0.38 m/sec (75 ft/min)。由於無法提供櫃內操作物種的 潔淨保護，目前各生技相關產業中第一級安全櫃的使用已逐 漸減少，多為被用於密閉的設備，如離心機、小型發酵機或 伴隨有潛在產生大量氣膠的製程中使用。此級安全櫃依不同 防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室 內。

14 第二級安全櫃 第二級安全櫃結構設計如圖，主要針對無菌的動物組織、細胞培殖與病毒繁殖的試驗操作，因此安全櫃需提供櫃內操作物的潔淨保護。 其防護原理是以櫃內層流配合HEPA FILTER的使用來提供一個無菌的操作環境，此級安全櫃可提供人員、環境及產品三層面的保護。安全櫃運轉時，氣流經前方開口由外界引入於操作區內，用以保護人員不受操作物逸散的污染，流入操作區的外氣隨即被風壓引導流入循環室，以不流經過試料為原則，藉以保護試料產品的安全。排氣則需通過HEPA FILTER，可以被再循環回實驗室裡或被排出至建築物外。而後，流經HEPA FILTER到操作區的氣體流場需提供試料保護、隔離外氣及排出氣膠的功能，以將安全櫃工作臺面的交叉污染減到最低。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。

15 第三級安全櫃 第三級的生物安全櫃結構設計如圖所示，其使用時機在於操作被歸類於生物安全第四級的微生物試劑，通常安裝於已經管制出入、特殊通風或特殊防護系統的最嚴格污染控制實驗室內。 安全櫃的內部需為一個漏氣率低於10-5ml/sec的封閉空間，並含一個封閉的觀察視窗，對於試料在此封閉的安全櫃是採取通過一浸水槽（可穿過安全櫃臺面）或雙層門的開口箱（如一雙門滅菌鍋）方式進出。此型式安全櫃的供給與排出氣體均需經過HEPA FILTER過濾。對外排氣時，氣壓應受安全櫃外部的專用獨立排氣系統所控制，以保持安全櫃任何時刻均在負壓狀態下，負壓值通常約為0.124 kPa。此類型安全櫃的實驗操作為利用附加於安全櫃窗口的密封橡膠手套進行，以避免使用者直接接觸危險的物質。

16 A. 視窗開口(front opening) B. 視窗(sash) C. 排氣HEPA FILTER(exhaust HEPA filter) D. 排氣室(exhaust Plenum) E. 工作臺面 F. 格狀開口(grille)

17 A. 視窗開口 B. 視窗 C. 排氣HEPA FILTER D. 供氣HEPA FILTER(Supply HEPA filter) E. 後氣室(Rear plenum) F. 風機

18 A. 手套端的O形環(glove ports with O-ring for attaching arm-length gloves to cabinet)
C. 排氣HEPA FILTER D. 供風HEPA FILTER E. 兩頭型滅菌鍋或傳遞箱(Double ended autoclave or pass-through box) Note: 在安全櫃中化學浸泡槽應被裝置在工作臺面之下。

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20 細菌與細胞無菌操作之比較 1.通常細菌用與細胞用之無菌操作台要分開 不交叉使用(避免污染) 2.第一級生物操作台不建議細胞培養(為避免污染)
若用於細菌培養則限定於非致病菌 第二級垂直式操作台則適用於細胞及細菌(保護人員環境 及實驗物) 3.無菌操作時細胞培養時dish和flask的蓋子取下時需要朝 上(細菌培養則較不要求) ，手不能往上揮過。

21 謝謝~