2.5 蛋白质的一级结构及测定 一、蛋白质结构概述 二、蛋白质一级结构 (一)概念 (二)测定 三、蛋白质与生物进化.

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1 2.5 蛋白质的一级结构及测定 一、蛋白质结构概述 二、蛋白质一级结构 (一)概念 (二)测定 三、蛋白质与生物进化

2 一、蛋白质结构概述 蛋白质结构的主要层次 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 primary structure
secondary structure 超二级结构 结构域 supersecondary structure Structure domain 三级结构 Tertiary structure 四级结构 quariernary structure

3 蛋白质的结构层次

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5 二、蛋白质一级结构 (一)概念：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置，称为蛋白质的一级结构(primary structure)。

6 蛋白质一级结构的生物学意义： 蛋白质的一级结构是蛋白质最基本的结构，它包含着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。

7 (二)蛋白质一级结构的测定：即多肽链中AA排列顺序，包括二硫键的位置。
英国的Sanger等于1953年（35岁）首先完成牛胰岛素的全部化学结构的测定。并因此获得了1958年（41岁）的诺贝尔化学奖。 1965年，我国科学家牛胰岛素的全合成。

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9 蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 测定每个肽碎片的AA顺序 两种以上方法 专一性裂解 AA组成分析(含每种AA的mol数、末端AA鉴定) 二硫键拆开 获得纯的pro样品，测定多肽链的数目(可通过末端分析确定) 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。

10 多肽N、C-末端氨基酸的测定 1、N-端氨基酸单元分析的原则 在N-端氨基酸残基上加上一个特定标记基团，这种标记基团有颜色、荧光、紫外吸收等性质，分离鉴定、得到N-端氨基酸的信息。

11 2、N-端氨基酸单元分析常用方法 N端： Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸酯反应）

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13 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNFB + Gly-Ala-Phe DNP-Gly-Ala-Phe DNP-Gly Ala Phe
105oC pH=8-9 室温 多肽或蛋白质的游离末端-NH2与DNFB反应，生成DNP多肽或DNP-蛋白质。水解多肽或蛋白质后，N末端氨基酸为黄色DNP-AA衍生物。用乙酸乙酯抽提出α-DNP-AA，通过层析技术进行分离鉴定。缺点：灵敏度低、肽键都要被水解掉!

14 Edman化学降解法(异硫氰酸苯酯法) 第一步、偶联反应 第二步、环化反应 少一个氨基酸残基的肽 ATZ（噻唑啉酮苯胺）

15 第三步、转化反应 PTC-氨基酸 （苯氨基硫甲酰氨基酸） ATZ(噻唑啉酮苯胺) 测定咪唑衍生物的R，即可知是哪种氨基酸。 PTH-氨基酸
（苯乙内酰硫尿氨基酸）

16 Edman化学降解法的特点 每进行一次Edman降解，除多肽N端的一个氨基酸残基脱下外，其余多肽链会保留下来。
这样就可以连续不断的测定剩余多肽链的N端AA，最终测得此多肽链的全部AA序列!

17 3、C-末端测定 A、肼解法(测定C端最常用的方法) ：
当蛋白质（或多肽）与无水肼在100℃反应5-10h后，除C端氨基酸外，所有氨基酸都转变成相应氨基酸的酰肼，C端氨基酸则以游离氨基酸放出。 NH2-NH oC h Gly-Ala-Phe GlyNHNH AlaNHNH Phe

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19 蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法
二硫键拆开 AA组成分析(含每种AA的mol数、末端AA鉴定) 两种以上方法 专一性裂解 测定每个肽碎片的AA顺序 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

20 二硫键的断裂 胰岛素 -巯基乙醇（还原法） 碘乙酸（烷化剂，保护巯基）

21 多肽链的部分裂解

22 羟胺法：能专一性的断裂-Asn-Gly-之间的肽键。但
化学法： 羟胺法：能专一性的断裂-Asn-Gly-之间的肽键。但 专一性不很强，Asn-Leu和Asn-Ala键也能 裂解。 溴化氰法：只断裂Met残基的羧基参加形成的肽键。 酶解法： 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶等

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25 消化道内几种蛋白酶的专一性 氨肽酶 羧肽酶 羧肽酶 （Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys） （Phe. Trp） （脂肪族）
胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 胰蛋白酶

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29 片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意 所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S
第一套肽段: CKS PS ECVE RLA HCWT 第二套肽段: SEC WTCK VERL APS HC 借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基 H S 第一套肽段 HCWT CKS ECVE RLA PS 第二套肽段 HC WTCK SEC VERL APS 推断全顺序 HCWTCKSEC VERLAPS

30 例：某八肽 完全水解后，经分析氨基酸的组成为：丙、亮、赖、苯丙、脯、丝、酪、缬。 端基分析：N-端 丙……………………亮 C-端。 胰凝乳蛋白酶催化水解：分离得到酪氨酸，一种三肽和一种四肽。 用Edman降解分别测定三肽、四肽的顺序，结果为：丙-脯-苯丙；赖-丝-缬-亮。 由上述信息得知，八肽的顺序为：

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32 三、蛋白质一级结构与生物进化

33 1）蛋白质氨基酸的顺序与生物进化

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36 例、细胞色素C的种属差异和分子进化 细胞色素C是一种含血红素辅基的单链蛋白，由124个AA残基构成，在生物氧化反应中起重要作用。

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38 细胞色素C的分子进化树 生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13
黑猩猩 恒河猴 兔 袋鼠 牛、猪、羊、狗 马 鸡、火鸡 响尾蛇 海龟 金枪鱼 角饺 小蝇 蛾 小麦 粗早链孢霉 酵母

39 细胞色素c分子的空间结构 不同生物来源的细胞色素 C中不变残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。 不变的AA残基
14 10 6 100 1 34 32 30 29 27 18 17 67 59 52 51 48 45 41 38 87 84 82 80 70 68 91 Gly Phe Cys Arg Lys His Pro Leu Tyr Ala Asn Trp 75 Ile Thr Met 血红素 细胞色素c分子的空间结构 不变的AA残基 不同生物来源的细胞色素 C中不变残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。

40 五、蛋白质一级结构的个体差异

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42 蛋白质一级结构与功能