Clonging in E.coli 大肠杆菌表达系统

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1 Clonging in E.coli 大肠杆菌表达系统
Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

2 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
Objective & Demands Need to master the expression methods in E. coli be familiar with vectors used in E. coli Need to know how to get a mutant by homologous recombination Class period 2h Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

3 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
Main content 一：大肠杆菌表达外源基因的优势 二 大肠杆菌表达载体的基本组成 三 常用的大肠杆菌表达载体 四 真核基因在大肠杆菌中的表达 五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题 六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 七. 人胰岛素的生产方法 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

4 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
一：大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin) heterogous periplasm Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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二 大肠杆菌表达载体的基本组成 一个良好的大肠杆菌表达载体： 有抗菌素抗性基因 决定载体拷贝数的复制起点 (ori ) 供外源基因插入的多克隆位点。 参与控制转录与翻译的必不可少的原件 外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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1启动子 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 Account for inducible Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2 终止子 a : 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子 b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。 c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

8 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。 大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

9 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
3转译起始序列 initiation factor mRNA的5末端之独特的结构特征 , 是决定mRNA转译起始效率的主要因素。 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。 conserved sequence universial 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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4、reporter gene 其编码产物可被快速测定的功能单元。 usage 追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导入寄主细胞 同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为检测启动子功能的依据。 β－半乳糖苷酶基因lacZ 、 碱性磷酸酶基因、 荧光素酶基因 (luciferase )基因、 半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat ) 四环素抗性基因 (tetr ) alkaline phosphatase Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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三 常用的大肠杆菌表达载体启动子 广泛使用的大多数质粒表达载体启动子 λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子 Lactose Operon Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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四 真核基因在大肠杆菌中的表达 1 外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置 在细胞质中表达 在细胞周质中表达 以分泌到细胞外的形式表达。 cytoplasm periplasm 三种表达部位各有不同的优缺点 // 而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm 包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。 insoluble 在表达中应尽可能限制包含体产生, 并促进形成天然三维结构的蛋白质。 多采用与分子伴侣共表达的方法, 可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。 chaperon Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2 ) 周质中表达 expressed in periplasm 周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。 周质中表达外源蛋白质优点: A : 周质中蛋白质种类少 , 周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。 b: 周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠 c: 在周质中蛋白质降解不广泛。 来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中 , 其稳定性大约是在细胞质中的10倍 分泌表达优点 : 目的蛋白稳定性高: 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 intact 将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达 , 其N端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去 许多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸残基。 这些真核基因在大肠杆菌中表达时 , 蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。 excise Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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Perfect sound 分泌表达缺点 相对其它生物细胞 , 大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达; 外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多 目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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蛋白质的分泌机制 Sulfer 原核细胞周质中有多种分子伴侣 ,可阻止分泌蛋白随机折叠 random inner 分泌至细胞周质或培养基中 重组蛋白很少形成分子间二硫键 outer 与包涵体相比 分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象， 对蛋白酶不敏感 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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分泌型目的蛋白表达系统构建 bacteriocin 有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的磷酸酯酶 , 导致细菌内外膜的通透性增大。 permeability 将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上 转化 受体细胞 完全分泌型受体细胞 携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒 转化 重组大肠杆菌 --目的蛋白完全分泌 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2 融和蛋白质表达 将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起 , 并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 2.1 融和基因 二种类型 由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。 由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2.2 融和蛋白的表达策略 受体细胞的结构基因能高效表达 , 且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化 Base on 融合蛋白表达质粒的构建原则 外源基因应装在受体蛋白编码基因下游 , 为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下 , 并不需要完整的受体结构基因 在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点 , 可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白 attention 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 , 它直接决定融合蛋白的裂解。 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 consistent Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2.3 表达融合蛋白质的优点 使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。 可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。 可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。 能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。 ribosome Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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intensify 3 整合型异源蛋白的表达 3.1 整合形式表达目的蛋白的特点 目的基因稳定表达 整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA一起复制, 在大多数情况下相当稳定 工程菌在没有选择压力存在下 ,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒, 这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义 replicate/ stability Species/ improvement 目的基因表达率低 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制 , 此时可通过强化表达元件加以补偿 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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3.2 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组 同源序列依赖型的体内重组 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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转位因子依赖型的体内重组 转位因子 transposon 生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子 噬菌体 G片段 (G-Fragment ) 原核微生物 插入顺序 (IS ) 真核微生物 转座子 (Tn、Ty ) 高等植物 可移动因子 (Ac、Ds ) 高等动物 跳跃基因 (mobile gene ) Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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transposon 转位因子的结构 palindrome inversion region repressor Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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整合形式 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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同源序列依赖型的体内重组 一般地说 , 距离越远、长度越长、同源性越高 , 重组的频率也就越高 , 反之亦然。 同源整合 同源整合 同源整合 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题 1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制； 2 转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子 3 mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴 ，在5末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力， 阻止正常的转录和转译。 4真核生物的蛋白质 ---有些是通过前体分子加工来的。 在细菌中不存在这种修饰作用。 5细菌的蛋白酶 ---可以识别和降解真核生物的蛋白质产物 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 domain 1 工程菌遗传不稳定性表现形式 region 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性 , 具有下列两种表现形式 Deletion 结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学功能的丧失 rearrange 分配不稳定性 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸 segregative instability Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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2 工程菌遗传不稳定性的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应 ， 关闭合成途径 ，启动降解 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 Deletion Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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3 改进载体、受体系统 以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点: 禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统 。 eg:大肠杆菌的ssb基因 (DNA单链结合蛋白编码基因) Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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4 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素) 根据载体上的营养缺陷型标记 , 向培养系统中添加相应的营养组份(培养基复杂 , 成本较高) correspond Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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5 控制目的基因过量表达 使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度 replicon 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数(优化基因工程菌的培养工艺) 培养基组成 : 限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度 : 较低培养温度有利于重组质粒的稳定 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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七. 人胰岛素的生产方法 immunogenic 基因工程法生产人胰岛素 1982年 , 美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别 具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。 potential Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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SH C C C C COO_ N C C S.S. Pre-pro-insulin S C C C C COO_ C C S-S Pro-insulin N S C C C C COO_ C C S S S-S insulin N Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

37 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列 表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链分别表达法 1 synthesis Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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A链和B链分别表达法 生产技术评价 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本 , 美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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proinsulin 人胰岛素原表达法 基因工程菌的构建战略 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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生产技术的评价 在人胰岛素原表达工艺中 , 由于C肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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44 Principles of Gene Manipulation by liuzengran
分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。 Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business

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HOMEWORK How to express insulin in E. coli, design the process. Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business