第二章 植物组织培养 的基本原理.

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1 第二章 植物组织培养 的基本原理

2 细胞全能性和细胞分化 器官发生 体细胞胚胎发生 影响植物离体形态发生的因素

3 知识点: 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？
？？ 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？ 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？ 影响植物离体形态发生的因素有哪些？

4 第一节 植物细胞全能性和细胞分化 植物组织培养的核心理论： 植物细胞全能性理论（Haberlandt, 1902）。

5 细胞全能性概述 细胞脱分化 细胞再分化

6 一、植物细胞的全能性（Totipotency）
定义：1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。 20世纪80年代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。

7 从一个细胞发育成一个植株

8 植物细胞全能性的证明是通过1958年Steward等胡萝卜根段细胞体胚发生试验及1964年Guha等进行的曼陀罗花药培养。

9 细胞全能性的相对性: 细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物; 动植细胞全能性的表现程度存在明显的差异.

10 细胞按照分裂能力分为三类: 第一类是始终保持分裂能力,如茎尖、根尖及形成层细胞；
第二类是永久失去分裂能力的终端分化细胞，如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞； 第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。

11 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。

12 根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心>形成层>薄壁细胞>厚壁细胞（木质化细胞）>特化细胞（筛管、导管细胞） 根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织（基本组织）>厚角组织>辅导组织>厚壁组织

13 植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）过程，可形成再生植物。

14 细胞全能性 脱分化 个体再生 再分化 细胞分裂 细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。

15 二、植物细胞分化 1、定义： 分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。 细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。是基因选择性活化或阻遏的结果。 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。

16 2、植物细胞分化的某些规律和机理 （1） 细胞分化分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。
（1） 细胞分化分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。 （2）植物中细胞发育的途径一旦被“决定”（determination），通常不易改变。而离体培养可以通过脱分化而丧失这种“决定”。 （3）分化与极性（Polarity）关系密切。

17 （4） 细胞分裂对细胞分化具有重要作用。特定环境条件下进行的细胞分裂可以导致特定的细胞分化，由不等分裂形成的分化细胞说明了细胞质在细胞分化中的作用。
（5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，促进长芽。 （6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响比较大。如核内多倍体的形成。

18 三、细胞脱分化 1、脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。 如叶柄基部的薄壁细胞成为离层细胞；伤害导致局部细胞形成愈伤组织。

19 2、脱分化的机理 脱分化诱导期间会导致细胞膜透性改变， 细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成， 过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃 等。但目前对于脱分化的机理尚未完全阐明。

20 3、影响脱分化的主要因素 （1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。
（2）在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合细胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 （4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。 （5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。

21 三、愈伤组织（callus）培养 １、愈伤组织的形成
在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。

22 黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织

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24 形成过程（三个时期）： 诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。
分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。 分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

25 2、愈伤组织的生长 （1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织， 细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。 （2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。 （3）生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。

26 3、愈伤组织的保持 – 转接 在多数情况下，随着继代培养代数增加和培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降、降低甚至死亡。所以在此之前，应及时转接至新鲜培养基上。 主要原因：遗传因素，染色体畸变、基因突变； 生理因素，细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变。后者可以通过调控培养条件而恢复。

27 4、愈伤组织形态发生 （1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成微管化组织和瘤状结构。
（2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。

28 器官发生 体细胞胚胎发生

29 四、细胞再分化（redifferentiation）
1、概念 ：指离体培养的植物细胞和组织可 以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种 或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成 完整植株。

30 组织培养中的再分化包括下面4个水平： 细胞水平的再分化 组织水平的再分化 器官水平的再分化（器官发生） 植株水平的分化（植株再生）

31 细胞水平的再分化：愈伤组织生长、不断分裂，分化出不同的细胞类群。主要有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、石细胞、纤维细胞等。

32 组织水平的再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是微管束（Vascular tissue）的分化。松散的愈伤组织内含大量拟分生组织或瘤状结构；致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。

33 器官水平的再分化：由分化出的不同组织形成各种器官，如芽、茎、叶、根等。
根据起源不同，分为两种类型： 直接器官发生（器官型）：直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。 间接器官发生（器官发生型）：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。

34 植株水平的再分化（植株再生）：根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。
离体培养中再生植株的主要途径有： 器官发生 胚胎发生

35 2、影响细胞再分化因素： （1）不同植物种类再分化的能力差异很大； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能让所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异很大； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。

36 第二节 离体条件下植物器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成根、芽、茎等器官的过程。不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根或芽。

37 一、器官发生再生植株的方式： A 先形成芽，芽的基部后产生后根； B 先形成根，根上再出芽；
C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来.

38 二、器官发生的过程： 分为两种： 经过愈伤组织的器官发生 不经过愈伤组织的器官发生

39 经过愈伤组织的器官发生过程 愈伤组织形成 生长中心形成 器官原基及器官形成

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41 不经过愈伤组织的器官发生过程 有两种情况： 外植体直接发生芽 茎尖培养中芽形成

42 第三节 植物体细胞胚胎发生 一、什么是植物体细胞胚胎发生？
第三节 植物体细胞胚胎发生 一、什么是植物体细胞胚胎发生？ 定义：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。 体细胞胚胎发生具有普遍性，目前已在200多种被子植物上观察到体胚发生过程。

43 合子胚的 发生过程

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45 双子叶植物胚胎发生： 合子－原胚－球形胚－心型胚－鱼雷胚－子叶胚 单子叶植物胚胎发生： 合子－原胚－球形胚－盾型胚－子叶胚 体细胞胚胎发生与合子胚发生阶段类似，但体胚形成由体细胞（或小孢子等性细胞）形成。

46 合子胚与体胚比较 合子心型胚 正在萌发的体胚

47 二、体细胞胚胎发生过程 1、发生过程： 一般分为5个阶段：胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗。 双子叶植物：体胚经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚到子叶胚等阶段。 单子叶植物：与双子叶植物诱导发生过程类似，只是在形态上无鱼雷形胚等阶段，成熟体胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等结构。

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49 挪威云杉体细胞胚胎发生及体胚生长状态

50 针叶松体细胞胚及体胚萌发生长

51 2、胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异
（1） 胚性愈伤组织，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁，并高度染色，胞质浓厚。典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。 （2）胚性细胞DNA、RNA以及蛋白质的合成更活跃，淀粉、可溶性糖含量增加，内源多胺含量升高，同工酶和内源激素合成变化明显。 如胡萝卜胚性愈伤组织淀粉含量高出非胚性愈伤组织的15~40倍。

52 3、体细胞胚胎发生的基因表达机理 植物体胚发生的过程非常复杂，牵涉到4000多个相关基因，以体胚发育后期，表达的基因可达1000多个。
在植物体胚发生过程中，会出现与基因表达有关的一系列生物大分子的有规律变化. 如蛋白质含量变化和特异蛋白质（胚性蛋白）出现与消失。 由于其复杂性，目前对体胚发生的机制了解不多。

53 三、植物体细胞胚胎发生途径 1、直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。
Direct somatic embryogenesis in Brassica napus

54 2、间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段： （1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。 （2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。

55 Somatic Embryogenesis Induction in Delonix regia (Boger
Somatic Embryogenesis Induction in Delonix regia (Boger.) Raf (Royal Poinciana)

56 花椰菜体胚发育的不同阶段

57 菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察

58 四、体细胞胚胎发生的机理 1、体细胞胚胎的起源： 起源存在争论，但绝大多数体细胞胚胎起源于单细胞。
细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。

59 生理隔离：在早期胚性细胞与周围细胞存在胞间连丝，但是随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞（类似小孢子发生）。
2、体细胞胚胎发生机理： 体胚具有两个明显特点：极性和生理隔离 极性：单个胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。极性获得的诱因是激素和外界刺激。 生理隔离：在早期胚性细胞与周围细胞存在胞间连丝，但是随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞（类似小孢子发生）。

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61 3、体细胞胚胎发生过程中的的生理生化： （1）蛋白质与核酸代谢； （2）多胺代谢变化； （3）糖类、矿质营养变化； （4）内源激素变化；
（5）活性氧代谢变化 。

62 第四节 影响植物离体形态发生的因素 一、植物种类和基因型 二、培养材料的生理状态 1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。
2、同一物种不同基因型间存在较大差别。 二、培养材料的生理状态 1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高； 2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好； 3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。

63 三、 培养基 1、营养成分 一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。
茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。 茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。 碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。

64 2. 植物激素及生长调节剂 （起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）
（1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 – D诱导体细胞胚胎发生。 （2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。 （3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。 （4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用 （5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。

65 3、培养基的性质 （1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。 （2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。
（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高.

66 四、培养条件 1、光照 培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。 光强一般要求 lx。植物间有所差别。 光照周期为10~16h/日。不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。

67 2、温度： 大多数培养温度为25±2℃. 花药培养低温或高温预备处理。 3、气体： 氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。

68 思考题: 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？
？？ 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？ 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？ 影响植物离体形态发生的因素有哪些？