微生物与发酵工艺 知识点3.2.

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1 微生物与发酵工艺 知识点3.2

2 知识点3.2 第一节 发酵过程中的代谢变化与控制参数 第二节 温度对发酵的影响及其控制 第三节 pH值对发酵的影响及其控制

3 知识点3.2 第四节 溶解氧对发酵的影响及其控制 第五节 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 第六节 CO2和呼吸商

4 知识点3.2 第七节 补料的控制 第八节 泡沫对发酵的影响及其控制 第九节 发酵终点的判断 第十节 发酵过程检测与自控
知识点3.2 第七节 补料的控制 第八节 泡沫对发酵的影响及其控制 第九节 发酵终点的判断 第十节 发酵过程检测与自控

5 第一节 发酵过程中的代谢变化与控制参数 微生物发酵有三种方式即分批发酵(batch fermentation)、补料分批发酵(fed-batch fermentation)和连续发酵(continuous fermentation)。 工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。

6 一、初级代谢的代谢变化 生长过程仍显示停滞期（1、2）、对数期（3、4）、稳定期（5）和衰亡期（6）等生长史的特征。

7 工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)的菌体，以尽量缩短停滞期。

8 二、次级代谢的代谢变化 次级代谢产物的发酵属于菌体的生长与产物非偶联的类型，菌体生长繁殖阶段(又称生长期)与产物生成阶段(又称生产期)是分开的。 UAA—可利用的氨基酸；NH3N—氨基氮

9 ⒈ 菌体生长阶段 菌体DNA含量达到定值，即不进行繁殖，细胞数量恒定，但多元醇、脂类等细胞内含物仍在积累，使菌体干重增加，此时开始合成产物，此刻的菌体浓度称为临界浓度。 这个阶段一般又称为菌体生长期或发酵前期，也有人称为平衡期 ⒉ 产物生成阶段 这阶段一般称为产物生产期或发酵中期。

10 ⒊ 菌体自溶阶段 这个阶段一般称为菌体自溶期或发酵后期。 根据发酵过程中的参数变化绘制出的次级代谢的代谢曲线，可清楚地说明过程中的代谢变化，并反映出碳源、氮源的利用和pH值、菌体浓度和产物浓度等参数之间的相互关系。 分析研究代谢曲线，还有利于掌握发酵代谢变化的规律和发现工艺控制中存在的问题，有助于改进工艺，提高产物的产量。

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12 三、发酵过程的主要控制参数 ⑴ pH值(酸碱度) ⑽ 浊度（OD值） ⑵ 温度(℃) (11) 料液流量 ⑶ 溶氧浓度（DO值，简称溶氧） ⑷ 基质含量 (12) 产物的浓度 ⑸ 空气流量 (13) 氧化还原电位 ⑹ 压力 (14) 废气中的氧含量 ⑺ 搅拌转速 (15) 废气中的CO2含量 ⑻ 搅拌功率 (16) 菌丝形态 ⑼ 黏度 (17) 菌体浓度（简称菌浓）

13 小型发酵罐

14 第二节 温度对发酵的影响及其控制 一、温度对发酵的影响
第二节 温度对发酵的影响及其控制 一、温度对发酵的影响 温度会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。 温度对化学反应速度的影响常用温度系数（Q10）（温度每升高10 ℃，化学反应速度所增加的倍数）来表示。

15 发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解吸收速率等，都受温度变化的影响，进而影响发酵动力学特性和产物的生物合成。

16 二、影响发酵温度变化的因素 产热的因素有生物热(Q生物)和搅拌热(Q搅拌)；散热因素有蒸发热(Q蒸发)、辐射热(Q辐射)和显热(Q显)。产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热[Q发酵，kJ／(m3·h)]， 即 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射。这就是发酵温度变化的主要因素。 ⒈ 生物热(Q生物)； ⒉ 搅拌热(Q搅拌)； ⒊ 蒸发热(Q蒸发) ；⒋ 辐射热(Q辐射)

17 三、温度的控制 ⒈ 最适温度的选择 最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的，可采用变温发酵。 ⒉ 温度的控制

18 通用式发酵罐

19 通用式发酵罐

20 第三节 pH值对发酵的影响及其控制 一、pH值对发酵的影响

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22 二、发酵过程pH值的变化 三、发酵pH值的确定和控制 ⒈ 发酵pH值的确定 同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。 同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。

23 ⒉ pH值的控制 在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况

24 ① 第一种情况是μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制；② 第二种情况是Qp (或μ)的最适pH值范围很窄，而μ(或Qp)的范围较宽(b)；
③ 第三种情况是μ和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制；④ 第四种情况更复杂，μ和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。

25 补料方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。
少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。 最成功的例子就是青霉素的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围(现已实现自动化)，其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25％。

26 第四节 溶解氧对发酵的影响及其控制 一、溶解氧对发酵的影响 影响耗氧的因素有以下几方面： ⑴ 培养基的成分和菌浓显著影响耗氧
第四节 溶解氧对发酵的影响及其控制 一、溶解氧对发酵的影响 影响耗氧的因素有以下几方面： ⑴ 培养基的成分和菌浓显著影响耗氧 ⑵ 菌龄影响耗氧 ⑶ 发酵条件影响耗氧 满足微生物呼吸的最低氧浓度叫临界溶氧浓度(critical value of dissolved oxygen concentration)，用c临界表示

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28 初级代谢的氨基酸发酵，需氧量的大小与氨基酸的合成途径密切相关。
根据发酵需氧要求不同可分为三类

29 第一类有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第二类，包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；第三类，有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。

30 第一类氨基酸是经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成的，产生的NADH量最多。因此NADH氧化再生的需氧量为最多，供氧愈多，合成氨基酸当然亦愈顺利。第二类的合成途径是产生NADH的乙醛酸循环或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统，产生的NADH量不多，因而与供氧量关系不明显。第三类，如苯丙氨酸的合成，并不经过TCA循环，NADH产量很少，过量供氧，反而起到抑制作用。 由此可知，供氧大小是与产物的生物合成途径有关。

31 二、供氧与微生物呼吸代谢的关系 微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。 呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以 QO2表示，单位为mmol O2／(g干菌体·h)。 耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmol O2／(L·h)。

32 r——微生物的耗氧速率，mmol O2／(L·h)； ——菌体的呼吸强度，mmol O2／(g干菌体·h)；
式中 r——微生物的耗氧速率，mmol O2／(L·h)； ——菌体的呼吸强度，mmol O2／(g干菌体·h)； c(X)——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。

33 三、发酵过程溶氧的变化 谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线 红霉素发酵过程中溶氧和黏度的曲线

34 引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因： ① 污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显； ② 菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降； ③ 某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。

35 四、溶氧浓度控制 ㈠ 氧的传递方程式 液相体积氧传递系数KLα代表氧由气相至液相传递的难易程度，它与发酵过程控制、放大和反应器设计密切相关。 当发酵液中溶氧浓度保持稳定，即发酵过程中的氧传递量与氧消耗量达到平衡时，KLα可由下式确定： 当微生物的耗氧速率r不变，同时液相饱和溶氧浓度c*不变， KLα愈大，液相实际溶氧浓度cL愈高，故可用KLα的变化来衡量发酵罐的通气效率。

36 式中 OTR——氧由气相向液相的传递速率(传氧速率，oxygen take rate)，mmol O2 ／(L·h)； KLα——液相体积氧传递系数，1／h； c*——液相饱和溶氧浓度，mmol O2 ／L； cL——液相实际溶氧浓度，mmol O2 ／L； OUR——菌的耗氧速率(摄氧速率，oxygen uptake rate)，mmol O2／(L·h)。

37 ㈡ 溶氧浓度控制 在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数KLα值。 发酵液的需氧量，受菌浓、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌浓的影响最为明显。 临界比生长速率，以μ临表示 最适菌浓，即c(X)临

38 第五节 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制
一、菌体浓度对发酵的影响及控制 P=QPmc(X) 式中 P——发酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率)，g／(L·h)； QPm——产物最大比生成速率，h-1； c(X)——菌体浓度，g／L。

39 影响菌体生长的环境条件有温度、pH值、渗透压和水分活度等因素。
按照Monod方程式来看，生长速率取决于基质的浓度，当基质浓度c(S)>10 Ks时，比生长速率就接近最大值。 对抗生素这类次级代谢产物来说，控制菌体的比生长速率μ比μ临略高一点的水平，达到最适菌浓[即c(X)临]，菌体的生产率最高。 在微生物发酵的研究和控制中，营养条件(含溶氧)的控制至关重要。

40 为了获得最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。

41 二、基质对发酵影响及其控制 ⒈ 碳源对发酵的影响及其控制 按菌体利用快慢而言，分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。 前者(如葡萄糖)能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解代谢产物，因此有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用； 后者(如乳糖)为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的生产期，也为许多微生物药物的发酵所采用。

42 选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的
糖对青霉素生物合成的影响试验

43 ⒉ 氮源对发酵的影响及其控制 氮源有无机氮源和有机氮源两类 如谷氨酸发酵，当NH4+供应不足时，就促使形成α-酮戊二酸；过量的NH4+，反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺 发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。 如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液、玉米浆

44 ⑴ 补加有机氮源 根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等

45 ⑵ 补加无机氮源 补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源，又可调节pH值。在抗生素发酵工业中，通氨是提高发酵产量的有效措施。当pH值偏高而又需补氮时，就可补加生理酸性物质的硫酸铵，以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的

46 ⒊ 磷酸盐对发酵的影响及其控制 磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的 磷酸盐浓度的控制，对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那么严格。对抗生素发酵来说，常常是采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度 其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素 其他培养基成分影响发酵，如Cu2+，Mn2+

47 第六节 CO2和呼吸商 一、CO2对菌体生长和产物形成的影响 CO2对菌体的生长有直接作用，引起碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降
CO2会影响产黄青霉菌(penicillium chrysogenum)的形态 CO2对细胞作用机制

48 二、CO2的释放率 连续测得排气氧和CO2浓度，可计算出整个发酵过程中CO2的释放率(Carbon dioxide release ratio，简称CRR)。 式中 ——二氧化碳比释放率，mmol CO2／(g干菌体·h)； c(X)——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。

49 三、呼吸商与发酵的关系 耗氧速率OUR可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量进气和排气中的氧含量计算而得，并最终计算出呼吸商RQ RQ可以反映菌的代谢情况，酵母发酵，RQ=1，糖有氧代谢，仅生成菌体，无产物形成；RQ>1.1，糖经EMP生成乙醇 RQ是碳-能源代谢情况的指示值

50 四、CO2浓度的控制 CO2的大小受到许多因素的影响，如菌体的呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小等因素 CO2浓度的控制应随它对发酵的影响而定 CO2的产生与补料工艺控制密切相关 补糖、CO2、pH值三者具有相关性，被用于青霉素补料工艺的控制参数 采用测定CRR作为控制补糖速率参数

51 第七节 补料的控制 补料分批发酵(fed-batch culture，简称FBC)，又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。

52 同传统的分批发酵相比，FBC具有以下的优点：① 可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；② 可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学的性质；③ 可用作为控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；④ 可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。 同连续发酵相比，FBC不需要严格的无菌条件，产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。

53 (a)恒化培养系统 (b)恒浊培养系统 1容器 2控制阀 3培养室 4排出管 5光源 6光电池 7流出液
实验室连续培养系统示意图 (a)恒化培养系统 (b)恒浊培养系统 1容器 2控制阀 3培养室 4排出管 5光源 6光电池 7流出液

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55 一、FBC的作用 ⒈ 可以控制抑制性底物的浓度 如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少 ⒉ 可以解除或减弱分解代谢物的阻遏 如缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍 ⒊ 可以使发酵过程最佳化

56 二、补料的方式及控制 补料方式有很多种情况，有连续流加、不连续流加或多周期流加。每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。从补加培养基的成分来分，又可分为单组分补料和多组分补料。 流加操作控制系统又分为有反馈控制和无反馈控制两类。 反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器三个单元所组成。根据控制依据的指标不同，又分为直接方法和间接方法。

57 第八节 泡沫对发酵的影响及其控制 一、泡沫的形成及其对发酵的影响 形成的泡沫有两种类型：
一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫； 另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluid foam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限

58 泡沫的多少一方面与发酵罐搅拌、通风有关；
另一方面，与培养基性质有关。 发酵时起泡的方式被认为有五种： ① 整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平； ② 发酵早期，起泡后稳定地下降，以后保持恒定； ③ 发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升；④ 发酵开始起泡能力低，以后上升； ⑤ 以上类型的综合方式。

59 二、泡沫的消除 ① 调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会 ② 采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫 ③ 还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素

60 对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。

61 ⒈ 机械消泡 这是一种物理消泡的方法，利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂

62 ⒉ 消泡剂消泡 这是利用外界加入消泡剂，使泡沫破裂的方法。 理想的消泡剂，应具备下列条件：① 应该在气-液界面上具有足够大的铺展系数，才能迅速发挥消泡作用；② 应该在低浓度时具有消泡活性；③ 应该具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；④ 应该对微生物、人类和动物无毒性；⑤ 应该对产物的提取不产生任何影响；⑥ 不会在使用、运输中引起任何危害；⑦ 来源方便，成本低；⑧ 应该对氧传递不产生影响；⑨ 能耐高温灭菌。

63 常用的消泡剂主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类及硅酮类等4大类
聚醚类消泡剂：聚氧丙烯甘油(简称GP型)；聚氧乙烯氧丙烯甘油(简称GPE型)，又称泡敌

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65 第九节 发酵终点的判断 生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。
式中，生产率单位一般为g／(L·h)或kg／(m3·h)，产物浓度单位为g／L或kg／m3，发酵时间单位为h。

66 生产过程不能只单纯追求高生产率，而不顾及产品的成本，必须把二者结合起来，既要有高产量，又要降低成本。
要确定一个合理的放罐时间，需要考虑下列几个因素： 一、经济因素 二、产品质量因素 三、特殊因素 另外，放罐时间对下游工序有很大影响

67 第十节 发酵过程检测与自控 检测的方法有： 物理测量(如温度、压力、体积、流量等)
物理化学测量(pH值、溶O2、溶CO2 、氧化还原电位、气相成分等) 化学测量(基质、前体、产物等的浓度) 生物学和生物化学测量(生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等)

68 生物传感器测量原理

69 一、发酵过程对传感器的特殊要求 传感器除了满足常规要求，诸如：可靠性、准确性、精确度、响应时间、分辨能力、灵敏度、测量范围、特异性、可维修性等，还应当满足一些特殊要求： 一般要求传感器能与发酵液同时进行高压蒸汽灭菌 其次是在发酵过程中保持无菌的问题 还有一个问题是传感器易被培养基和细胞沾污

70 二、发酵过程的主要在线传感器 ⒈ pH值 一般采用可原位蒸汽灭菌的复合pH传感器 ⒉ 溶氧
一般使用覆膜溶氧探头，它实际测量的是溶氧分压，与溶氧浓度并不直接相关，故测量结果称为溶氧压（dissolved oxygen tension，简称DOT），它以饱和值(即与气相氧分压平衡的溶氧浓度)的百分数表示 pH计 溶氧仪

71 cL=c*·DOT 式中 P——实际操作压力，Pa； c0*——在 MPa压力下的饱和溶氧浓度，mol／m3或mmol／L； c*——在实际操作压力P下的饱和溶氧浓度，mol／m3或mmol／L； cL——发酵液中溶氧浓度，mol／m3或mmol／L； DOT——溶氧传感器测量的溶氧压，％。

72 三、发酵过程自控 ① 和过程的未来状态相联系的控制目的或目标（如要求控制的温度、pH值、生物量浓度等）； ② 一组可供选择的控制动作（如阀门的开、关，泵的开、停等）； ③ 一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型（如用加入基质的浓度和速率控制细胞生长速率时需要能表达它们之间相关关系的数学式）。

73 过程监控计算机在发酵自控中的作用有： ① 从发酵过程中采集和存贮数据； ② 用图形和列表方式显示存贮的数据； ③ 对存贮的数据进行各种处理和分析； ④ 和检测仪表和其他计算机系统进行通讯； ⑤ 对模型及其参数进行辨识； ⑥ 实施复杂的控制算法。

74 思 考 题 ⒈ 发酵产品生产中控制的参数有哪些？排气中二氧化碳控制的意义是什么？
思 考 题 ⒈ 发酵产品生产中控制的参数有哪些？排气中二氧化碳控制的意义是什么？ ⒉ 发酵过程温度升高的原因及其对微生物生长和产物合成的影响有哪些？发酵温度如何进行管理？ ⒊ 生产中为什么要对pH值进行控制？如何进行控制？

75 思 考 题 ⒋ 临界溶氧浓度的概念及意义。供氧与微生物代谢有何关系？如何控制溶氧？
思 考 题 ⒋ 临界溶氧浓度的概念及意义。供氧与微生物代谢有何关系？如何控制溶氧？ ⒌ 基质浓度对发酵有何影响？如何进行控 制？FBC的优点与作用。 ⒍ 消泡的方法有哪几种？各有何优缺点？ ⒎ 发酵过程主要在线传感器有哪些？使用 时应注意什么问题？

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