武汉职业技术学院 微生物技术应用 背景知识四：微生物生长测定技术.

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1 武汉职业技术学院 微生物技术应用 背景知识四：微生物生长测定技术

2 知识节点一 微生物的营养 知识节点二 微生物培养基及制备技术 知识节点三 微生物的生长规律 知识节点四 微生物生长繁殖的测定技术 知识节点五 环境对微生物生长的影响

3 知识节点一 微生物的营养 一、微生物是由哪些化学元素组成的？ 二、微生物需要哪些营养物质？各有什么作用？生产和实验中常由哪些物质充当？
三、微生物有哪些营养类型？各类型的典型微生物有哪些？ 四、微生物营养物质如何运输到细胞内的？

4 一 微生物细胞的化学组成 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 微生物细胞 水：70%-90% 无机物（盐） 干物质 有机物
一 微生物细胞的化学组成 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 水：70%-90% 微生物细胞 无机物（盐） 干物质 有机物 蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等 及其降解产物 细胞化学元素组成： 主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。

5 二、微生物的营养物质及其作用 微生物与动植物营养要素的比较 微生物生长所需要六大营养要素： 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水、能源

6 1 碳源（Carbon source） ◆定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。 ◆功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。 ◆种类: 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、 麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、 醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物 以及各种含氮的化合物。 在碳源物质中糖类是一般微生物最广泛利用的碳源，其次是醇类、有机酸和脂类等。在糖类中，单糖胜于双糖和多糖。 目前在发酵工业中用做碳源的物质主要是糖类物质，即单糖、饴糖、淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等）、麸皮、各种米糠等。另外，国内外开展了以纤维素、石油、CO2和 H2等作为碳源与能源来培养微生物的代粮发酵的科学研究. 目前已能利用石油或石油产品作为碳源来生产氨基酸、维生素、辅酶、有机酸、核苷酸、抗生素与酶制剂等各种有用产品，利用纤维素的研究一直报道很多。 另外有些有毒的含碳物质如氰化物、酚等也能被某些细菌分解与利用，可以利用这类细菌来处理它们，主要在环保上应用。 微生物不同，利用上述含碳化合物的能力不同，如假单胞菌属中的某些种可以利用90种以上的不同类型的碳源物质；而某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物进行生长。

7 微生物工业发酵中用做碳源的原料 传统种类：糖类（单糖，饴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物 淀粉等） 麸皮 各种米糠等
淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物 淀粉等） 麸皮 各种米糠等 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2 常用碳源 实验室： 葡萄糖 蔗糖 淀粉 甘露醇 等 发酵工业： 玉米粉 米糠 麸皮 糖蜜

8 2氮源（Nitrogen source ）： 凡用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。 种类：无机氮：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、 尿素、 氨、N2等； 有机氮：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、 氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、 黄豆饼粉、玉米浆等 功能： 1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料； 2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。 以蛋白质形式存在的氮源不能被微生物直接吸收利用，必须通过微生物分泌的胞外蛋白水解酶将蛋白质分解之后才能被利用。在黄豆饼粉、花生饼粉里所含的氮则主要是以蛋白质的形式存在，这种蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。 而无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源叫做速效氮源，例如硫酸铵中的氮以还原态氮形式存在，可以直接被菌体吸收利用，蛋白质的降解产物特别是氨基酸直接可以通过转氨作用等方式被机体利用。 速效氮源，通常是有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。在工业发酵过程中，往往是将速效氮源与迟效氮源按一定的比例制成混合氮源加到培养基里，以控制微生物的生长时期与代谢产物形成期的长短，达到提高产量的目的。 速效氮源，通常是有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。在工业发酵过程中，往往是将速效氮源与迟效氮源按一定的比例制成混合氮源加到培养基里，以控制微生物的生长时期与代谢产物形成期的长短，达到提高产量的目的

9 功能：1、构成细胞结构组分； 2、作为酶组分或活化剂； 3、参与能量传递或提供能源； 4、维持结构稳定性； 5、调节渗透压。
3无机盐（inorganic salt） 定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式共给。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生长所需浓度在10-3~10-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生长所需浓度在10-6~10-8mol/L） 一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。 功能：1、构成细胞结构组分； 2、作为酶组分或活化剂； 3、参与能量传递或提供能源； 4、维持结构稳定性； 5、调节渗透压。 一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。

10 无机盐的生理功能 细胞内一般分子成分(如P，S，Ca，Mg，Fe等) 一般功能 维持渗透压 生理调节物质 酶的激活剂 大量 pH的稳定 元素
微量 一般功能 特殊功能 酶的激活剂（Cu2+、Mn2+、Zn2+等） 特殊分子结构成分（Co、Mo等） 维持渗透压 生理调节物质 酶的激活剂 pH的稳定 化能自养菌的能源(S、Fe2+、NH4+、NO2-) 无氧呼吸时的氢受体(NO3-、SO42-) 细胞内一般分子成分(如P，S，Ca，Mg，Fe等)

11 4 生长因子（growth factor）： 定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。 ◆嘌呤和嘧啶：用于合成核酸 (DNA and RNA) ◆氨基酸：蛋白质合成 ◆维生素：构成酶的辅基或辅酶 Growth Factors This simplified scheme for use of carbon, either organic carbon or CO2, ignores the possibility that an organism, whether it is an autotroph or a heterotroph, may require small amounts of certain organic compounds for growth because they are essential substances that the organism is unable to synthesize from available nutrients. Such compounds are called growth factors. Growth factors are required in small amounts by cells because they fulfill specific roles in biosynthesis. The need for a growth factor results from either a blocked or missing metabolic pathway in the cells. Growth factors are organized into three categories. 1. purines and pyrimidines: required for synthesis of nucleic acids (DNA and RNA) 2. amino acids: required for the synthesis of proteins 3. vitamins: needed as coenzymes and functional groups of certain enzymes Some bacteria (e.g E. coli) do not require any growth factors: they can synthesize all essential purines, pyrimidines, amino acids and vitamins, starting with their carbon source, as part of their own intermediary metabolism. Certain other bacteria (e.g. Lactobacillus) require purines, pyrimidines, vitamins and several amino acids in order to grow. These compounds must be added in advance to culture media that are used to grow these bacteria. The growth factors are not metabolized directly as sources of carbon or energy, rather they are assimilated by cells to fulfill their specific role in metabolism. Mutant strains of bacteria that require some growth factor not needed by the wild type (parent) strain are referred to as auxotrophs. Thus, a strain of E. coli that requires the amino acid tryptophan in order to grow would be called a tryptophan auxotroph and would be designated E. colitrp-. Some vitamins that are frequently required by certain bacteria as growth factors are listed in Table 3. The function(s) of these vitamins in essential enzymatic reactions gives a clue why, if the cell cannot make the vitamin, it must be provided exogenously in order for growth to occur. 有些异养型微生物由于失去了（或从未有过）合成一种或多种组成细胞所必需的有机化合物的能力，因此，必须由外源提供这些有机化合物才能生长，将这些物质统称为生长因子，其中包括：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶及其衍生物、甾醇、 胺类、脂肪酸等等。 种类：维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4~C6的分支或直链脂肪酸、氨基酸 缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”微生物。

12 根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：
◆野生型(wild type) 原养型 不需要生长因子而能在基础培养基 上生长的菌株 ◆营养缺陷型(auxotroph) 由于自发或诱发突变等原因从野生 型菌株产生的需要提供特定生长素物 质才能生长的菌株

13 5 水 水是微生物最基本的组成分（70％—90％） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）
5 水 水是微生物最基本的组成分（70％—90％） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）

14 三、微生物的营养类型 自养型生物 生长所需要的营养物质 异养型生物 光能营养型 生物生长过程中能量的来源 化能营养型

15 光能自养型：以光为能源，不依赖任何有机物即可正常生长
光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养 化能自养型：以无机物的氧化获得能量，生长不依赖有机营养物 化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质

16 四、微生物营养物质的运输 营养物质通过质膜的方式有4种： 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团转移

17 知识节点二 微生物培养基及制备技术 一、什么是培养基？ 二、培养基有哪些类型？各自有什么用途？ 三、配制培养基应遵循什么原则？如何操作？

18 一 微生物培养基 定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。
特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。 用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品

19 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素： 碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水 任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理； ◆常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟某些成分进行分别灭菌； ◆过滤除菌；

20 二、培养基的类型及应用 （一）按微生物的种类分类 细菌培养基，放线菌培养基，霉菌培养基，酵母培养基 （二）按培养基的成份分类
可分为合成、天然、半合成培养基。 （三）按培养基用途分类 可分为基础培养基、富集培养基、选择培养基、鉴别培养基等 。 （四）按培养基的物理状态分类 可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基

21 三、培养基的制备技术 （一）配制培养基的原则 虽然培养基的配方和种类很多，但是培养基的制备遵循以下的原则 。 1.适合目标微生物的营养特点
2.按微生物需要量调好营养物浓度和配比 3.控制微生物的培养条件 4.经济节约原则

22 （二）培养基的制备方法 根据培养的微生物种类和目的选择适当的培养基配方和类型，按照下面基本步骤制备培养基。

23 注意： 配制培养基时应注意防止产生沉淀、光热分解和杂菌感染等造成营养成份的损失。 易受高温破坏的试剂单独配制，过滤灭菌后，在使用前加入。

24 知识节点三　微生物的生长规律 一、单细胞微生物的生长有什么规律？（生长曲线） 二、微生物生长规律对工业生产有什么指导意义？

25 一、单细胞微生物的生长曲线 微生物繁殖方式多种多样，生长繁殖和死亡的规律也不完全相同。

26 单细胞微生物（如细菌、酵母菌）的典型生长曲线包
延滞期、指数期、稳定期和衰亡期 真菌的生长曲线大致可分3个时期 生长延滞期、快速生长期和生长衰退期。

27 （一）延滞期/停滞期/调整期/适应期 特点：细胞数目恒定或增加很少，生长速率R＝0。 原因：接种到新鲜培养液中的细菌的代谢系统需要一些时间来进行调整，包括重新调整酶和细胞结构成份以适应新环境，一般不立即开始繁殖。

28 细菌延滞期的长短： 取决于菌种的遗传特性、菌龄、菌种的接种量及接种前后培养条件的差异等，从几分钟到几小时不等。 以指数期的菌作种子，子代培养物的延滞期短。

29 （二）指数期 特点：生长速率常数R最大，代时（世代时间或增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间最短 原因：延迟期末，细菌已适应了新环境，平衡生长，菌体各部分的成份按比例有规律地增长，各种酶活性高而稳定，代谢活力强，分裂速度快，菌数以几何级数增加，其生长曲线表现为1条上升的直线，如右图。

30 世代时间的计算： N t= 2 n No ， n为繁殖代数 (lgNt—lgNO) n= ——————— =3.322(lgNt—lgNO) lg2 3.322（lgNt——lgNO） 其生长速率常数 R = ——————————— ( t2— t1) ( t2­­— t1) G= —— = —————————— R （lgNt— lgNO）

31 （三）稳定期 特点：细菌的繁殖速率和死亡率趋于平衡即生长速率常数R＝0 原因：在指数末期，由于营养物质尤其是生长限制因子的耗尽、营养物营养物的比例失调如C／N比不合适等、酸、醇、毒素或H2O2有害代谢产物的积累及培养环境中pH和Eh等物理化学条件的变化，使细菌的繁殖速率下降而死亡率逐渐上升。

32 （四）衰亡期/对数死亡期 特点：微生物群体呈现负生长状态(R<0)，活菌数的对数与时间成反比，按几何级数下降 原因：由于营养和环境条件的进一步恶化，细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，使死亡率迅速增加，这时尽管群体的总菌数仍然可能较高，但活菌数急剧下降，微生物的个体死亡速度超过新生速度。

33 二、微生物生长规律 对工业生产的指导意义 1．缩短延滞期 缺点：延滞期将延长生产周期而降低设备的利用率 2．把握对数期
在发酵工业中通过连续流加或补加发酵原料，使菌体随着营养浓度增加而提高生长速率， 提高得率。

34 3．延长稳定期 通过补料，调节pH、温度或通气量等措施来延长稳定期。向发酵体系中连续流加营养物、移走代谢产物的培养方式即为连续培养。 特点：对微生物的生存是必需的；各种微生物产生种类相似的初级代谢产物；这些产物的形成与微生物细胞的形成过程同步，见图4-6（a）和图4-7（a） 最佳收获时机:稳定期

35 次级代谢 次级代谢产物：与微生物的生存、生长和繁殖无关的代谢产物（抗生素、生长激素、生物碱、维生素、色素和毒素等）
特点：形成过程与微生物细胞生长过程不同步，见图4-6（b）、图4-7（b）和图4-7（c）。 形成的高峰往往在微生物生长的稳定期后期或衰亡期。通过连续培养等方式，可以延长稳定期，提高次级代谢物的产量。

36 4．监控衰亡期 进入衰亡期，积累的微生物代谢毒物可能与代谢产物发生反应或影响提纯，必须在合适时候结束发酵 　

37 知识节点四 微生物生长繁殖的测定技术 微生物生长测定的方法分为计繁殖数和测生物量两类，每一类中又有直接测量的方法和间接测量的方法。
一、每种方法什么情况下适用？有什么有缺点？ 二、每种方法怎样进行？ 三、如何绘制生长曲线？

38 一、计繁殖数（一）直接法 显微计数法 2. 粒子计数器法 3．菌丝长度测定法 （二）间接法 1．比色法 2．稀释平板计数法 3．液体稀释培养计数法 4．浓缩法 二、测生物量（一）直接法 细胞干重法 2. 细胞堆积体积测定法 （二）间接法 1．总氮量测定法 2．DNA含量测定法 3．ATP测定法 4．代谢活性法

39 一、计繁殖数 （一）直接法 1. 显微计数法 采用血球计数板法进行计数，即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测并记录小室内细胞的个数，计算出样品中细胞的浓度。

40 一、计繁殖数 （一）直接法

41 2. 粒子计数器法

42 2、粒子计数器法 适用范围：单细胞微生物 优点是可以同时测出细胞数目和大小 缺点是无法区分细胞与其他固体颗粒，因此样品中不能有细胞以外的其他颗粒存在。

43 3．菌丝长度测定法 针对丝状真菌生长的测定，是活菌的测量方法。

44 1．比色法（比浊法） 根据在一定的浓度范围内，菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度呈反比的原理，可使用分光光度计测定各种微生物悬液中细胞的数量。一般选用450～650 nm波长。

45 2．稀释平板计数法 通常是先将待测样品作一系列稀释，每个稀释度在三个以上的平皿中培养生成菌落，即菌落形成单位（CFU），取其平均值，根据合适稀释度的平皿菌落数进行含菌量计算。

46 一、计繁殖数 （二）间接法 菌落数x稀释倍数=菌体个数/每毫升原样

47 两种常用的平板计数法操作方法

48 一、计繁殖数 （二）间接法 液体稀释培养计数法
本法特别适合于测定土壤微生物中特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其它食品中特殊微生物类群的数量。

49 液体稀释培养计数法操作示意图

50 4．浓缩法 适用范围：本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。 方法：测定时让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置（如微孔滤膜等），富集其中的微生物，然后处理滤膜使之透明，显微计数，或者将收集的微生物洗脱后按上面各法测数，再换算成原来水或空气中的数量。

51 二、测生物量 二、测生物量 （一）直接法 1. 细胞干重法 2. 细胞堆积体积测定法 （二）间接法 1．总氮量测定法 2．DNA含量测定法
3．ATP测定法 4．代谢活性法

52 五 环境对微生物生长的影响 生长是微生物与外界环境因子共同作用的结果。 微生物与环境之间相互作用 影响微生物生长的外界因素很多 主要有 物理
主要有 物理 化学 生物因子 最主要的是营养物质、水、温度、pH和O2 培养基时控制微生物的培养条件是一条基本原则。

53 有哪些因素影响微生物的生长？怎样影响？ 一、营养物质 二、水的活性和渗透压 （一）水的活度 （二）渗透压 三、温度 （一） 温度对微生物的作用 （二）微生物的温度类型 四、pH值 五、氧和Eh值

54 限制性营养物浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响
一、营养物质 限制性营养物浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响

55 二、水的活性和渗透压 缺水的干燥环境不适于微生物生活，长期失水将导致死亡。渗透压主要影响溶液中水的可给性，若环境溶液中的溶质过高，渗透压过大，也将抑制微生物的生长繁殖（高糖高盐环境抑制微生物生长）。

56 三、温度 微生物的生命活动都是由一系列在酶催化下进行的生化反应组成的，这些反应受温度影响极其明显。温度还影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性。 微生物生长和适应的温度范围从-12～100℃或更高，但仅针对某一种微生物而言，则只能在有限的温度范围内生长，并具有最低、最适和最高三个临界值。这就是生长温度三基点。

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59 四、pH值

60 五、氧和Eh值 一般在环境Eh值大于0.1V时才生长并以0.3～0.4V为适宜的微生物称为好氧菌。一般要求环境Eh值小于0.1 V才生长的称为厌氧菌。两种条件均可生长但代谢方式各异的称为兼性厌氧菌，此类微生物在Eh值小于0.1V时进行发酵作用，大于0.1 V时则进行呼吸作用。

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