实验一 植物培养基配制.

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1 实验一 植物培养基配制

2 实验目的 掌握培养基配制方法 掌握高压蒸汽灭菌方法

3 准备工作 器具洗净备齐 准备水 准备化学试剂 母液的配制和保存 2.2.2 培养基的制备 准备工作 配制培养基所用的主要器具要洗净备齐 。
  准备水 准备化学试剂 母液的配制和保存 2.2.2 培养基的制备 准备工作 配制培养基所用的主要器具要洗净备齐 。   配制培养基一般用蒸馏水或无离子水。精细的试验须用重蒸馏水。 化学药品应采用化学纯CP(三级)及分析纯AR(二级)，以免杂质对培养物造成不利影响。   母液的配制和保存 3

4 组成 含量 mg/L Mg/ml 贮藏液浓度 （倍） 添加量
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Na2EDTA FeSO4.7H2O 甘氨酸 盐酸硫胺素(VB1) 盐酸吡哆醇(VB6) 烟酸 肌醇 蔗糖 琼脂(g) pH 1650 1900 170 370 440 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 37.25 27.85 2.0 0.4 0.5 100 30,000.0 8,000.0 5.8 每回称量 .. 558 215╱250 620 83 25╱100 25 745 557╱100 100╱50 20╱50 25╱50 2500╱250 1,000 10,000 200 10 1 0.1 5 MS培养基

5 配制培养基所需母液量(ml)或直接称量量（g）
MS培养基母液配方（本实验用） 成 分 母液倍数或 浓度（mg/ml） 配制1.0L培养基所需量 配制培养基所需母液量(ml)或直接称量量（g） 大量元素 20倍液 ml 微量元素 200倍液 铁盐 有机物质 蔗糖 30 g 琼脂 8 g NAA 1.0 mg/ml KT 6-BA 1.0mg/ml 2,4-D pH值 5.8

6 在烧杯中加入一定量的水，按顺序加入一定量的母液
培养基的制备 在烧杯中加入一定量的水，按顺序加入一定量的母液 加入植物生长调节剂、定容 调pH值 加入琼脂，加热溶解 培养基分装，封好瓶口 培养基灭菌 培养基存放

7 MS1: MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+琼脂8g/L （烟草愈伤组
织诱导及不定器官形成） MS2: MS + NAA 0.2 mg/L + KT 1.0 mg/L+琼脂8g/L（烟草苗的微 繁殖） MS3: MS+ 2,4-D 1.0 mg/L（烟草细胞悬浮培养）

8 实验二 烟草愈伤组织诱导

9 实验目的 掌握无菌操作技术 观察愈伤组织诱导过程

10 实验步骤 第一步：超净工作台清洁、灭菌（70-75%乙醇、紫外） 第二步：无菌操作前，开启超净工作台风机，调节风速
第三步：将实验所需的实验材料、培养基放入超净工作台 （ 70-75%乙醇） 烟草无菌苗；MS1 第三步：实验者清洁手臂后用70-75%乙醇喷雾表面消毒 第四步：接种操作（无菌操作） 擦拭台面 点燃酒精灯 镊子、手术刀、剪刀等浸泡在无水乙醇或95%乙醇 打开培养基、实验材料的封口材料，准备培养皿 镊子、手术刀、剪刀灼烧灭菌 切离适宜大小的叶片外植体 将外植体转移进培养基，封口，写上培养材料名称、培养基名称、接种 者姓名及接种日期 切记：手不要从开口的容器上方经过；不要将灭好菌的器械放在培养皿上。 第五步：将接种完成的培养材料放入培养室培养 烟草愈伤组织诱导培养条件：25℃ 暗培养 第六步：清洁工作台面

11 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周

12 实验三 烟草茎段快繁

13 实验目的 掌握无菌操作技术 掌握离体快繁技术

14 实验步骤 第一步：超净工作台清洁、灭菌（70-75%乙醇、紫外） 第二步：无菌操作前，开启超净工作台风机，调节风速
第三步：将实验所需的实验材料、培养基放入超净工作台 （ 70-75%乙醇） 烟草无菌苗；MS2 第三步：实验者清洁手臂后用70-75%乙醇喷雾表面消毒 第四步：接种操作（无菌操作） 擦拭台面 点燃酒精灯 镊子、手术刀、剪刀等浸泡在无水乙醇或95%乙醇 打开培养基、实验材料的封口材料，准备培养皿 镊子、手术刀、剪刀灼烧灭菌 切离适宜大小的茎段外植体 将外植体转移进培养基，封口，写上培养材料名称、培养基名称、接种 者姓名及接种日期 切记：手不要从开口的容器上方经过。 第五步：将接种完成的培养材料放入培养室培养 烟草茎段培养条件：25℃ 光照培养 第六步：清洁工作台面

15 第0周 第1周 第2周 第3周

16 实验四 烟草细胞悬浮培养

17 实验目的 掌握无菌操作技术 掌握细胞悬浮培养转移技术

18 实验步骤 第一步：超净工作台清洁、灭菌（70-75%乙醇、紫外） 第二步：无菌操作前，开启超净工作台风机，调节风速
第三步：将实验所需的实验材料、培养基放入超净工作台 （ 70-75%乙醇） 烟草愈伤组织；MS3 第三步：实验者清洁手臂后用70-75%乙醇喷雾表面消毒 第四步：接种操作（无菌操作） 擦拭台面 点燃酒精灯 镊子等浸泡在无水乙醇或95%乙醇 打开培养基、实验材料的封口材料 镊子灼烧灭菌 将生长旺盛、疏松的愈伤组织转移进液体培养基，轻轻将愈伤组织团分离 封口，写上培养材料名称、培养基名称、接种者姓名及接种日期 切记：手不要从开口的容器上方经过。 第五步：将接种完成的培养材料放入培养室培养 烟草细胞悬浮培养培养条件：25℃ 弱光培养 第六步：清洁工作台面

19 第0周 第2周 第3周

20 原生质体分离、融合与细胞活力测定 (实验五、六、七)

21 一、实验材料 烟草叶肉细胞 烟草愈伤组织

22 二、器具、仪器和试剂 培养皿 、离心管、吸管、筛网、试管架、倒置显微镜、低速离心机、摇床等。 无菌水
20%蔗糖溶液、培养基、酶溶液、W5溶液、PEG融合剂。

23 过滤灭菌（0.22μm）

24

25 实验五 原生质体分离

26 烟草叶肉细胞(1g)、烟草愈伤组织(1g) 10ml酶液 酶解 原生质体释放（研磨） 原生质体纯化 （界面法、低速离心）
（25+2℃/6-9h、 50r／min暗）（镜检） 原生质体释放（研磨） （0.4mm孔径的不锈钢网筛） 原生质体纯化 （界面法、低速离心） 细胞活力测定 PEG-高钙、高pH融合 离心纯化：第一次（1ml蔗糖+4ml酶解夜）350xg/1500rpm 10min;第二次/三次（w5洗涤）200xg/1000rpm 4min 离心机的转速，在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示。由于离心力不仅为转速函数，亦为离心半径的函数，即转速相同时，离心半径越长，产生的离心力越大。因此仅以转速表达离心力是不够科学的，近年来主张用相对离心力（RCF）来表示比较合理。现在国际资料中，已改用相对离心力来表示。 两者的互换公式如下： N=RCF×105/1.18×R RCF= ×R×N2 N表示转速，单位为转/分（r/min）；R表示离心半径，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）； RCF表示相对离心力，单位用重力加速度Xg(g=9.8m/s2)。

27 烟草愈伤组织原生质体 原生质体活力的测定

28 烟草叶肉细胞原生质体

29 实验六 细胞活力测定 （染色法） 醋酸洋红（检测有活力的细胞） 甲基蓝（检测死细胞、破碎的细胞、活力较低的细胞） 0.005%~0.01%

30 醋酸洋红染色

31 甲基蓝染色

32 实验七 原生质体融合 洗涤（W5液、培养基） 培养 PEG-高钙、高pH融合
愈伤组织获得的原生质体与叶肉细胞获得的原生质体以一定的比例进行混合，混合液滴于无菌干燥的培养皿底部，液滴上滴加PEG融合液进行融合（10-15min）。 洗涤（W5液、培养基） 培养

33 原生质体融合情况

34 原生质体融合情况

35 实验八 根癌农杆菌介导的烟草叶片遗传转化

36 农杆菌转化程序 转化受体材料准备 供体菌株准备 感受态 侵染 共培养 选择培养 鉴定 植株再生 鉴定 分子生物学 形态学 第二步
（烟草叶片） 第二步 供体菌株准备 第一步 感受态 第三步 侵染 第四步 共培养 第五步 选择培养 第六步 鉴定 植株再生 第七步 分子生物学 形态学 鉴定 第八步

37 烟草遗传转化 引自：郝兴龙，华中科技大学硕士学位论文，2012

38 甘薯遗传转化 A-F:转基因植株再生； C,G-I:GUS染色； L:转基因薯块抗病鉴定 Gao S, Yu B, Yuan L, Zhai H, He SZ, Liu QC (2011): Production of transgenic sweetpotato plants resistant to stem nematodes using oryzacystatin-I gene. Scientia Horticulturae, 128: