第九章 植物原生质体融合技术.

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1 第九章 植物原生质体融合技术

2 植物原生质体融合又称体细胞杂交，是指将 不同来源的植物原生质体(除去细胞壁的细胞)相 融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技 术。 一般先将两种不同植物的体细胞经酶消化， 除去细胞壁，得到原生质体，而后通过物理或化 学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞，继而再以 适当的技术进行杂种细胞的分检和培养，促使杂 种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织直至杂种植 株，从而实现基因在远缘物种间的转移。

3 一、植物原生质体的制备 1. 植物原生质体的分离 (1) 机械分离法 细胞在高渗糖溶液中发生轻微质壁分离，原
生质收缩成球状后，再用机械法磨碎组织，原生 质体会从受损的细胞壁中释放出来。 优点：可避免酶制剂对原生质的破坏作用。 缺点：获得完整原生质的数量较少，利用此法产 生原生质体的植物种类有限。

4 (2) 酶解分离法 用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、R-10、 蜗牛酶、胼胝质酶、EA3-867酶等细胞壁降解酶， 脱除植物细胞壁，获得原生质体。 优点：可以应用于几乎所有植物及植物材料，以 获得大量原生质体。 缺点：酶制剂常污染有核酸酶、蛋白酶、过氧化 物酶以及酚类物质，会影响到原生质体的 活力。

5 2. 影响植物原生质体数量和活力的因素 (1) 细胞壁降解酶的种类和组合 叶片细胞 纤维素酶和果胶酶 根尖细胞 果胶酶+纤维素酶 花粉母细胞 蜗牛酶 小孢子(四分体) 胼胝质酶 成熟花粉 果胶酶和纤维素酶

6 (2) 渗透压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破 坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微 弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释 放，这种高渗液称为渗透压稳定剂。 常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗 糖、葡萄糖、盐类(KCl、MgSO4•7H2O)等。 渗透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物 种类而异，往往与酶制剂混合使用。

7 (3) 质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防 止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂 形成细胞团。 常用的质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、 氯化钙、磷酸二氢钾等。 (4) pH的影响 降解酶的活力和细胞活力最适pH不一致。低 pH(<4.5)时，酶的活力强，原生质体分离速度快，

8 但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶
活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体 数量较多。 (5) 温度影响 一般在26±1℃条件下酶解。 (6) 植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行 取材。 胚性愈伤组织及其悬浮细胞系

9 3. 植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混 合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器 及其他碎片除去。 (1) 过滤法 (2) 离心法：过滤低速离心 (3) 漂浮法：高渗溶液

10 4. 植物原生质体的培养方法 (1) 固体培养法(平板培养法) 将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂 (琼脂或低熔点琼脂糖)按一定比例混合，在培养 皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。 原生质体无细胞壁保护，培养基温度必须低 于45℃才能加入原生质体。注入后需轻轻摇动培 养皿，使原生质体均匀分布。

11 (2) 浅层液体培养法 在培养皿或三角瓶中注入3-4ml原生质体培养 液，然后将纯净的原生质体按一定细胞密度加入 并进行培养。培养期间每日轻轻摇动两三次，以 保证通气。 当原生质体细胞壁再生，并形成细胞团后， 立刻转至固体培养基上培养，方能增殖并分化成 植株。

12 (3) 双层培养法 在三角瓶内先注入细胞增殖的固体培养基， 然后在固体培养基上，加入适于原生质体胞壁再 生和细胞分裂的液体培养基，再按一定的细胞密 度注入原生质体制备液。固体培养基中的营养成 分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生 质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。 植物原生质体对培养密度较为敏感，低于 104/ml可能不分裂。为了解决低密度培养的问题 ，在双层培养基础上发展出饲养层培养和看护 培养。

13 二、植物原生质体的融合 1. 植物原生质体的融合技术 (1) 盐类融合法 常用的盐类融合剂有：
① 硝酸盐类，如NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2 ② 氯化物类，如NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2 ③ 葡聚糖硫酸盐类，如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫 酸钠 优点：对原生质体的活力破坏力小 缺点：异核体形成的频率不高

14 (2) 高Ca2+、高pH融合法 用高Ca2+诱发融合时，当钙离子浓度小于 0.03mol/L，原生质体很少聚集融合；当钙离子浓 度达到0.05mol/L时，融合效果很好。 用高pH诱发融合时，当pH在 之间，融 合率不高，当pH在 之间，融合效果很好。 高pH能使质膜表面特性发生改变从而促进融合。 优点：融合频率较高 缺点：较高的pH产生毒害作用

15 (3) 聚乙二醇融合法(PEG法) 1974年，Kao和Michayluk采用PEG处理原生 质体，使融合频率得到很大提高。 PEG诱导的融合没有特异性，能使各种原生 质体融合形成异核体。 PEG法的优点是操作较为简单，异核体形成 的频率很高，可重复性较强，对于大多数细胞类 型来说毒性很低，形成双核异核体的比例很高。

16 (4) PEG、高Ca2+、高pH相结合的融合法
使用高Ca2+ 、高pH溶液清洗PEG诱导后的原 生质体，融合频率得到进一步提高。 PEG作为两种原生质体表面的分子桥而起作 用，当PEG分子被高Ca2+ 、高pH溶液洗掉时，可 能引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而 促进了融合。

17 (5) 电融合法 电融合法是将一定密度的原生质体悬浮液至 于一个融合的小室中，小室两端装有电极。在不 均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近， 紧密接触，在两个电极间排列呈串珠状。这时若 施以足够强度的电脉冲，就可使质膜发生可逆性 电击穿，从而导致融合。 电融合在常温、pH5.8条件下完成，不附加有 害化学物质，避免了高pH、PEG等非生理条件， 同时融合条件更加数据化，便于控制和相互比较。

18 电融合一般分为两步进行。首先，将原生质 体置于低电导电解质溶液中，在电极间施加高频 交变电流，产生电脉效应，使原生质体偶极化并 沿电场线方向游动，排列成串珠状。接着，再给 予瞬间高强度的电脉冲一次或数次，引起膜的可 逆性破裂而导致融合发生。 整个融合过程大致可以划分为以下几个阶 段，原生质体接触、质膜融合、圆球化、核融 合。

19 　　影响电融合频率的因素很多。原生质体的密 度对融合效果有显著影响，一般认为2×104～ 8×104个细胞/ml的原生质体密度是适宜的。悬浮 液中CaCl2的浓度不仅影响悬浮液的导电率，也影 响原生质体的完整程度。此外，交变电流的强 弱、处理时间的长短、电脉冲的大小等因素对融 合的效果都有明显影响。

20 2. 融合体 (1) 自体融合 　　发生在亲本原生质体自身，融合的结果得到 “同核体”。 (2) 异体融合 　　由不同种的双亲原生质体融合得到“异核 体”。

21 ① 协和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组，即
双亲全套遗传信息，形成异源双二倍体。 ② 部分和谐的细胞杂种：原生质体融合时，双亲 的染色体经逐步排斥，但这种排斥是非完全性 的，仍可发生少量染色体组的重组，然后进入 同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植 株。

22 ③ 异胞质体细胞杂种：异胞质体细胞杂种，除含
本种之一的细胞核外，还含有异种的细胞质。 异胞质体形成的原因是由正常有核原生质体与 原生质体制备过程中，核丢失的“亚原生质体” 融合而成；或是异核体发育过程中，有一方排 斥调另一方的细胞核而形成的异胞质体。 ④ 嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体发生膜 融合和胞质融合后，不发生核融合。双亲的细 胞核各自发生分裂，形成细胞壁，最终形成嵌 合体植物。

23 三、杂种细胞的筛选 1. 互补选择法 两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在形 成杂种细胞时能产生互补作用，根据这一特性可
　　两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在形 成杂种细胞时能产生互补作用，根据这一特性可 对杂种细胞进行选择。

24 (1) 营养缺陷型互补选择法 　　利用融合亲本原生质体和杂种细胞对某种营 养物质需求不同的差异进行筛选。 硝酸还原酶缺失(NR－) NR脱辅基酶缺失(nia型) 钼辅助因子缺失(cnx型) 在硝酸盐作为唯一氮源的选择培养基上生长　 融合

25 (2) 生长互补选择法 　　根据融合双亲原生质体及其同源融合体和杂 种细胞对培养基中外源激素需求性的差异，淘汰 双亲原生质体和同源融合体，保留杂种细胞以达 到选择的目的。其本质是双亲原生质体和同源融 合体缺乏合成某种内源生长激素的能力，而杂种 细胞由于互补作用可以合成该生长激素。

26 (3) 抗性互补选择法 　　利用对抗生素、除莠剂或其他毒性物质的抗 性等显性性状来选择杂种细胞。当两个抗性系的 原生质体融合时，每个亲本的药物敏感性分别被 另一亲本的抗性掩盖，因而单抗的双亲细胞融合 后便形成了双抗的杂种细胞，很容易通过选择培 养基筛选出来。

27 (4) 白化突变体和隐性非等位基因互补选择法
例1：矮牵牛白化突变体在特定培养基中可以生长 并分化出茎叶，而拟矮牵牛在该培养基中不能再 生成细胞团，两者融合后，再生的绿色愈伤组织 或小苗即可认为是体细胞杂种。 例2：S烟草和V烟草是两个光敏突变体，又不同 的隐性等位基因控制，两者在正常光照下生长 慢，且再生的突变体愈伤组织为淡黄色，其原生 质体融合产物再生的愈伤组织在强光照下为绿 色，表明为杂种。

28 2. 机械选择法 (1) 天然颜色标记分离法 (2) 荧光素标记分离法 　异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸罗丹明(RITC) (3) 荧光激活细胞分选仪自动分离法 3. 组织培养筛选法

29 四、体细胞杂种的鉴定 1. 杂种植物的形态学鉴定 观察的内容主要有叶片、花的颜色、植株生 长习性等形态特征。
　　观察的内容主要有叶片、花的颜色、植株生 长习性等形态特征。 　　对于亲缘关系相近的种，融合再生植株的形 态介于双亲之间或偏向一方。远缘体细胞杂种， 尤其是有性杂交不亲合的组合，杂种形态变化较 多，有亲本型、居中型、变异型等几种。　　

30 在原生质体培养过程中的体细胞无性系变 异也会造成形态的改变，且与原生质体融 合产生的变异很难区分，因此形态学鉴定
　　由于形态学特征易受环境条件的影响， 在原生质体培养过程中的体细胞无性系变 异也会造成形态的改变，且与原生质体融 合产生的变异很难区分，因此形态学鉴定 只是初步的结果，必须配合其他方法。

31 2. 杂种植物的细胞学鉴定 　　以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体 数目、染色体长短、染色体反应、减数分裂染色 体配对情况等进行观察、比较。 　　核型分析的准确性优于形态特征鉴定，但同 样会遇到愈伤组织阶段染色体变异的干扰，必须 注意取样技术和判断准确性。

32 3. 杂种植物的生化分析与分子生物学鉴定 (1) 遗传标记 ① 同工酶：过氧化物酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶 ② 分子标记：RAPD、RFLP、AFLP、SSR、 　　　　　　 CAPS、ISSR (2) 染色体原位杂交(CISH) (3) 组分I蛋白

33 五、体细胞融合的意义 1. 克服生殖障碍，创造新种质 2. 转移有利性状，改善作物品质 3. 转移部分染色体，获得非对称杂种
4. 转移细胞质基因组，得到细胞质杂种

34 思考题 1.什么是原生质体？ 2.原生质体分离的方法有哪些？ 3.常用原生质体酶解分离的酶有哪些？ 4.常用的原生质体融合方法有哪些？