免疫学检测技术.

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1 免疫学检测技术

2 免疫学检测技术 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
大多物质都可以成为抗原，可用检测抗原的方法来检测

3 免疫学检测 一、 抗原抗体的检测 （一）体外抗原抗体结合反应特点、影响因素 （二）抗原、抗体的测定方法 二、 免疫细胞功能的检测
（一）免疫细胞的分离 （二）免疫细胞功能的测定 理论上大多物质都可以成为抗原，所以可以用检测抗原的方法来检测它； 测定抗原、抗体的方法是根据抗原抗体反应规律设计的

4 回顾几个概念： 1、免疫系统与免疫应答 [免疫应答，特异性免疫应答] 免疫系统清除异物的过程
2、[抗原，Ag]能诱导免疫系统产生特异性免疫应答的异物。 3、[抗体， Ab]特异性蛋白质，由抗原诱导，通过特异性免疫应答产生，B细胞转化为浆细胞分泌。与抗原一一对应。 4、抗原抗体反应的特异性 抗原抗体空间构型上互补，可以相互结合，特异性结合

5 抗体结构图

6 一、 测定抗原、抗体的方法 （一）体外抗原抗体结合反应特点、影响因素 1、体外抗原抗体反应（血清学反应）特点 1）特异性→设计检测抗原抗体的方法 2）可逆性 3）阶段性与可见性 特异性－检测抗原或抗体的基础 Ag Ab Ab 第一阶段 第二阶段 Ab Ag＋Ab Ag－Ab Ag－Ab Ag Ab

7 4）比例性与可见性 Ab Ab Ag＜＜Ab： Ag ，游离Ab Ab Ag Ab Ab Ag＋Ab Ag－Ab Ab Ag、Ab比例合适：

8 2、影响抗原抗体反应的主要因素 （第二阶段反应） 1）电解质 2）温度 一般定为37℃ 特殊，4度 3）酸碱度 pH 6～8 合适
一般定为37℃ 特殊，4度 3）酸碱度 pH 6～8 合适 4）其他： 机械振荡

9 如何检测抗原或抗体？ 抗原 ＋ 抗体 抗原抗体反应现象 ？ ＋ 抗体 抗原 ＋ ? 有现象 （有相应抗原） 无现象 （无相应 抗原）
抗原 ＋ 抗体 抗原抗体反应现象 ？ ＋ 抗体 抗原 ＋ ? 有现象 （有相应抗原） 无现象 （无相应 抗原） 特异性－检测抗原或抗体的基础 凝集反应利用凝集现象，沉淀反应利用沉淀现象等 有反应现象 （有相应 抗体) 无反应现象 （无相应抗体） （返回）

10 （二）测定抗原、抗体的方法 1、凝集反应 （1）概念 颗粒性Ag＋Ab → （凝集块） 可溶性Ag＋Ab → （沉淀物） （凝集反应）
1、凝集反应 （1）概念 颗粒性Ag＋Ab → （凝集块） 可溶性Ag＋Ab → （沉淀物） Ag Ab Ab Ag－Ab Ag Ab （细菌、细胞） Ab （凝集反应） 颗粒性Ag与可溶性Ag大小上差别 Ag Ab Ab Ag－Ab Ag （蛋白质、多糖） （沉淀反应） Ab

11 （2）类型 颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应） 可溶性Ag－载体＋Ab 凝集块（间接凝集反应） （细胞、细菌等） （正向间接凝集反应）
一定条件 颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应） 可溶性Ag－载体＋Ab 凝集块（间接凝集反应） （细胞、细菌等） （正向间接凝集反应） 可溶性Ag＋载体－Ab 凝集块（反向间接凝集反应） Ag ＋ 金葡菌－Ab 凝集块（协同凝集反应） （致敏载体?）

12 ①颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应）
（3）检测原理 一定条件 ①颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应） ？ ＋已知Ab ② Ag ＋ 金葡菌－Ab 凝集块（协同凝集反应） ？＋金葡菌－已知Ab 凝集（有对应Ag） 一定条件 无凝集（无对应Ag） 凝集（有对应Ag） 一定条件 无凝集（无对应Ag）

13 效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗体（或抗原）的效价，可反应待检物含量。
1. 稀释液 μl 弃去50 待检血清 （1：10） （Ab?） 50 稀释度 : : : : : : : :2560

14 5. 例如，效价＞1：40，判断为待检标本（抗体）阳性；否则阴性
1.稀释液 μl 弃去50 2.待检血清（1：10） （Ab?） 50 1: : : : : : : :2560 3.加Ag μl Ab最终稀释度 1: : : : : : : :5120 效价 4.现象 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1:320 :160 ＋＋ ＋ ＋ － － － － － :40 ＜ 1:40 5. 例如，效价＞1：40，判断为待检标本（抗体）阳性；否则阴性

15 2 、 沉淀反应 可溶性Ag + Ab 沉淀物 （1）凝胶内沉淀反应 （Ⅰ）单向琼脂扩散试验 （定量） 一定条件 Ag、Ab比例合适
（Ⅰ）单向琼脂扩散试验 （定量） Ag、Ab比例合适 沉淀反应可在溶液中进行，也可在琼脂等凝胶中进行 琼脂凝胶是…… 900C…… 400C……分子量小于20万，自由扩散 Ag浓度 Ab Ag Ag Ag Ag Ag 沉淀环直径2

16 Ab Make a agar plate containing Ab Ab Punch wells Ag Ab Ab Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag add Ag precipitate rings form

17 （Ⅰ）单向琼脂扩散试验 （定量） Ab Ag Ag Ag Ag Ag Ag concentration
Diameter2 (of ring ) （Ⅰ）单向琼脂扩散试验 （定量）

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20 （Ⅱ）双向琼脂扩散试验 （定性） Ag Ab （在Ag、Ab比例合适处形成沉淀线） Ab Ab ：标本中无Ag ？ Ag ？ Ag Ab
（Ⅱ）双向琼脂扩散试验 （定性） Ag Ab （在Ag、Ab比例合适处形成沉淀线） Ab Ab ：标本中无Ag 第129页，图13-2，图13-3 ？ Ag ？ Ag Ab ：标本中有Ag （相同抗原） 标本 阳性对照 ？ Ag

21 (Make a agar plate) (without Ab) (Punch wells) Ab
：no Ag in test sample 第129页，图13-2，图13-3 Ab ？ Ag ？ Ag ：same Ag in test sample (fuse) Ab Test sample (?Ag) Positive control ？ Ag

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23 (fusion) (cross) (spur)
Figure 10 Use double immunodiffusion to identify an unknown antigen

24 （2）免疫电泳技术 （Ⅰ）对流免疫电泳 电泳力： 电渗力： 合力： 运动方向： ＋ － pH 8.6 Ab Ag
（2）免疫电泳技术 （Ⅰ）对流免疫电泳 ＋ － pH 8.6 Ab Ag 电泳力： 电渗力： 合力： 运动方向： （反应速度加快，灵敏度提高）

25 对流免疫电泳检测方法： Ab － ＋ ？ 阳性对照（Ag） 待测标本（？Ag） （有沉淀线：有Ag； 无沉淀线：无Ag）

26 （Ⅱ）免疫电泳(immunoelectrophoresis)
原理：先利用电泳技术使蛋白抗原的各组分在琼脂内分离。然后在沿电泳方向挖一直槽，在槽内加入混合抗体，让抗原各成分与相应抗体进行双向琼脂扩散，形成多条沉淀线。可分析抗体成分或体液蛋白成分。 + - - + Ag Ag Ab Ab Ag Ag

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29 （3）免疫浊度法 原理：在特殊缓冲液中，当抗体过量的情况下，加入可溶性抗原时，形成肉眼看不见的小分子免疫复合物，使反应液呈现一定的浊度，可以使通过它的光束发生散射。抗原越多，形成的小免疫复合物越多，光散射越强，因此，通过测散射光强度可推断抗原的量。 简便、敏感、快速、易于自动化。

30 3、补体结合试验 指示系统 反应系统（待测） ？ 有Ag 溶血素 补体 不溶血 Ab SRBC （标本中有 Ag） ？ 溶血素 无Ag 溶血

31 4、免疫标记技术 （1）原理： 利用酶、荧光素、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗原或抗体，再与标本中的待测抗体或抗原反应；若标本中有抗体或抗原，会发生抗原抗体反应，在易显示物上有所体现，最后测定复合物中的易显示物来推断待测抗体或抗原的量或存在与否。 优点：高度的敏感性和特异性，简便、快速，可作定性、定量或定位测定。

32 免疫标记技术举例： （洗涤） （？） Ag ＋ Ab－荧光素 Ag －Ab－荧光素 （细胞表面可见荧光） ＋ Ab－荧光素 ＋ Ab－荧光素
最简单的基本原理 ＋ Ab－荧光素 ＋ Ab－荧光素 （洗涤）

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36 （2）分类： 依据检测目的分两类： 免疫组化技术：用于组织/细胞中抗原或抗体 的定位； 免疫测定：用于液体标本中抗原或抗体的检测 依据标记物的不同，可分为： 酶免疫技术 荧光免疫技术 金免疫技术 化学发光免疫技术 放射免疫技术

37 （3）酶免疫技术 酶免疫组化技术（如酶免疫电镜技术） 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本
enzymes: horseradish peroxidase, HRP alkaline phosphatase, AP substrate: DAB or TMB

38 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 属固相酶免疫测定
把待测标本(含有未知抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的顺序与固相抗原或抗体起反应，再洗涤固相载体，随后加入酶的底物，底物受酶催化转变为有色产物。根据颜色的深浅对待测物质定性或定量。

39 三种试剂： ①固相抗原或抗体 即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表面，同时保留它们的免疫活性；
①固相抗原或抗体 即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表面，同时保留它们的免疫活性； ②酶标抗原或抗体，即把某些酶用合适的方法连接到抗原或抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)； ③酶作用的底物

40 ELISA的类型： (Ⅰ)双抗体夹心法 测抗原 1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板
(Ⅰ)双抗体夹心法 测抗原 1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板 7）加底物显色，测定 （无Ag） （有Ag） （显色） （不显色）（定量）

41 A 96-well microtiter plate. This plate could be used for ELISA

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43 （Ⅱ）间接法 测抗体 1）己知抗原包被 2）洗板 3）加待检病人血清 4）洗板 5）加酶标记抗人IgG 6）洗板 7）加底物显色，测定 （Ⅲ）竞争法 测抗原或抗体 测定抗原：在待测管中加入受检抗原和酶标抗原，使它们同固相抗体进行竞争性结合。

44 1） 荧光抗体技术：荧光素标记在抗体上获得荧光抗体，对组织或细胞内的抗原进行定位。
（4）、荧光免疫技术 1） 荧光抗体技术：荧光素标记在抗体上获得荧光抗体，对组织或细胞内的抗原进行定位。 2）荧光免疫测定：用荧光抗体对待测标本中抗原或抗体进行定性或定量检测，如双抗体夹心法。 常用的荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RIB200) 、铕螯合物 流式细胞术 是荧光抗体技术同流式细胞仪分离技术的结合。经特异性荧光抗体染色的游离细胞逐个从流式细胞仪的喷嘴流出，再在电磁场的作用下发生偏转，同时在单色激光照射下发出荧光，不同细胞的荧光信号及偏转角度均不同，细胞得以分离。常用于T、B等细胞亚群的检测及分离。 荧光抗体技术，属免疫组化

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49 将化学发光反应与抗原抗体反应相结合，以检测抗原或抗体的方法。 可分为三类
（5）、化学发光免疫技术 将化学发光反应与抗原抗体反应相结合，以检测抗原或抗体的方法。 可分为三类 1）化学发光酶免疫测定 是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性； 2）化学发光免疫测定 直接用发光剂标记抗体或抗原，再进行抗原抗体反应，通过检测发光信号来测定抗原或抗体的含量。 3）电化学发光分析 优点：①灵敏度高，甚至超过放射免疫测定（RIA）②精密度和准确性与RIA相似；③测定快速、易自动化，试剂稳定且无毒害。

50 （6）、胶体金免疫技术 以胶体金为标记物的抗原抗体反应。常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等。 斑点金免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA) 以硝酸纤维素膜为载体 如早早孕试验，其检测原理如图所示：

51 金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）
B C T R A 金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG） 特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素） 固相特异性抗体（抗HCG） 固相抗小鼠IgG抗体

52 T区、 R区均出现红色线条，为阳性（两条红线）；
T区不出现红色线条，仅R(或C)区均出现红色线条，为阴性（一条红线）。

53 Is there anything wrong ? (first,positive;second,negative)
positive negative

54 （7）、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA) 是以放射性同位素为标记物的免疫测定法，用于定量测定标本中的抗原。

55 （8）免疫印迹法 (immunoblotting) 又名Western印迹法 第一步 用电泳法将抗原各成分分离；
第一步 用电泳法将抗原各成分分离； 第二步 用电转移法将分离的各成分转移到硝酸纤维膜上(电印迹)，然后将其浸于抗体中； 第三步 洗去未结合的抗体和杂质，在膜上加标记的抗人球蛋白抗体，最后加入底物显色或做放射自显影分析。

56 免疫吸附分离法/磁珠分离法/流式细胞术/抗原肽-MHC分子四聚体技术等
二 、 免疫细胞功能的检测 （一）、免疫细胞分离 1、外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法 Ficoll-Urografin分层液(1.077±0.001) 2.、淋巴细胞及其亚群的分离 免疫吸附分离法/磁珠分离法/流式细胞术/抗原肽-MHC分子四聚体技术等 3、单核巨噬细胞的分离和收集 斑蝥敷贴法；粘附在玻璃、塑料、尼龙毛

57 （二 ）、免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定 （1） T淋巴细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验）
原理：植物血凝素(phytoagglutinin，PHA)或抗原在体内或体外可以刺激T细胞增殖，使T细胞代谢和形态发生改变，转变成为淋巴母细胞。 方法：形态学方法 H-TdR掺入法等 （2）迟发型超敏反应（DTH）的检测 PPD皮肤试验 原理：是迟发型（Ⅳ型）超敏反应 方法：前臂皮内注射结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，24h～48h后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即为皮试阳性。

58 2. B细胞功能测定 （1）测各类Ig的含量 （2）抗体形成细胞测定（溶血空斑试验，plaque forming cell, PFC ）
原理： 绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠，取出脾细胞， +SRBC +琼脂  浇注成薄层  +补体观察溶血空斑数目与大小

59 脾细胞 +SRBC+补体

60 脾细胞 +SRBC+补体

61 3. 细胞毒试验（检测CTL、NK等活性） 4. 吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：中性粒细胞 （2）巨噬细胞吞噬试验： 鸡红细胞 5