第一组 钟燕玲 刘付燕春 黎丁瑜 罗筱 杜楷 陈思恰 邓辉云 陈波 卢晓闻 林武荣.

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1 第一组 钟燕玲 刘付燕春 黎丁瑜 罗筱 杜楷 陈思恰 邓辉云 陈波 卢晓闻 林武荣

2 病例二

3 杨X，男，21岁，某酒店餐饮部主任，因高 热，食欲不振，腹部不适，乏力一周入院。 一周前开始发热，午后高达40～41℃，伴 腹痛，腹胀便秘，无恶心、呕吐，不思饮食, 全身乏力，曾做上感治疗，用药不详。 入院检查：T：40.5℃，P：88次/分，R： 28次/分，神清、表情淡漠，消瘦，重听；舌 尖红、舌苔黄厚；右胸前皮肤有数个淡红色皮 疹，压之褪色。心肺未见异常，肝肋下1.5cm， 剑突下2cm，质软有轻度触痛，脾肋下2cm。 血常规：WBC：3000/mm^3,中性占56％，淋巴 占38％，单核占6％，未见嗜酸性粒细胞，EC直计“0”， 入院时血培养阴性，肥达反应结果：TO：1：160， TH：1：80，PA 1：20，PB 1：20，入院后第七天再 复查肥达氏反应，结果TO 1：640，TH 1：640， PA 1：20，PB 1：20。

4 思考 1、本病最初的诊断是什么？根据是什么？ 2、本病的发病机制是什么？ 3、为何血培养阴性？应如何进行病原学检 查？
3、为何血培养阴性？应如何进行病原学检 查？ 4、两次肥达反应结果说明什么？该患者除做肥达反应， 还可做何检查？

5 1、本病最初的诊断是 伤寒

6 诊断依据 1）症状体征： 高热40.5℃，伴腹痛，腹胀便秘，无恶心、呕吐，不思饮食，全身乏力，呼吸加速：28次/分，脉率相对缓慢 ：88次/分，皮疹 神情淡漠，肝脾轻度肿大并伴触痛（肝正常触不到，消瘦者可触及，但仅在肋缘下1里米内。脾正常也不能触及，未超过肋下2厘米为轻度肿大）

7 2）实验室检：（血常规）WBC：3000/ml 未见嗜酸性颗粒
肥达反应： 第一次：TO 1:160 ，TH 1:80， PA 1:20，PB:1: 第二次：TO 1:640 ，TH 1:640， PA 1:20，PB:1: (可见抗体呈四倍效价增长)

8 2、本病的发病机制是什么？ 伤寒的发病主要取决于伤寒杆菌的感染量、毒力以及人体的免疫能力.伤寒杆菌内毒素是重要的致病因素
伤寒杆菌随污染的水或食物进入消化道后，未被胃酸杀灭的细菌进入小肠内，于回肠末端穿过肠粘膜，侵入回肠集合淋巴结，孤立淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内，被巨噬细胞吞噬并在其胞浆内繁殖。伤寒杆菌通过胸导管进入血液，出现第一次菌血症。此阶段相当于临床上的潜伏期。 伤寒杆菌随血流进入肝、脾和其他网状内皮系统继续大量繁殖，再次进入血流，并不断释放内毒素，引起第二次菌血症和毒血症，引起一系列临床发病。 病程第2-3周，伤寒杆菌继续随血流播散全身，以胆囊进入肠道，大量细菌从粪便排出。来自胆囊的伤寒杆菌，部分通过小肠粘膜，再次入侵肠道淋巴组织，使原已致敏的肠道发生超敏反应，导致局部坏死和溃疡，严重的有出血或肠穿孔并发症。

9 淋巴组织产生严重炎症反应，加重肠道病变，引起肿胀、坏死、溃疡。若病变波及血管则可引起出血，若溃疡深达浆膜则致肠穿孔。病程第4～5周，人体免疫力增强，伤寒杆菌从体内逐渐清除，组织修复而痊愈，但约3%可成为慢性带菌者少数病人由于免疫功能不足等原因引起复发。 造成发热等症状的机理仍不完全清楚，多认为系菌体裂解后的内毒素作用于局部单核—巨噬细胞释放内致热原所致。还可能与巨噬细胞产生单核细胞活素，花生四烯酸等物质有关。

10 1.集合淋巴结、孤立淋巴结： 肿大：单核巨细胞增生致（纽扣样）坏死及溃疡形成（出血、穿孔）斑痕形成 2.系膜淋巴结：肿大、充血、坏死
伤寒杆菌 小肠腔内繁殖 肠道、肠系膜淋巴结：繁殖 1.集合淋巴结、孤立淋巴结： 肿大：单核巨细胞增生致（纽扣样）坏死及溃疡形成（出血、穿孔）斑痕形成 2.系膜淋巴结：肿大、充血、坏死 第一次菌血症 （胸导管引流） 肝、胆、脾内大量繁殖 脾：肿大、充血、坏死 肝：浑浊肿胀、变性、坏死 第二次菌血症、毒血症

11 3、为何血培养阴性？应如何进行病原学检查？
本病应根据病程不同采集不同标本。第一周取外周血，第一至三周取骨髓液，第二周起取粪便和尿液。患者发病一周后才入院，应取骨髓液或尿液培养。但医院是做血培养，所以血培养为阴性，可能是因为标本采集的来源不正确而导致血培养阴性。 患者曾作上感治疗，用药不详，不排除用过抗生素。由于抗生素的应用，可能部分杀灭伤寒沙门菌，血液中伤寒沙门菌含量少而导致血培养时伤寒杆菌的检出率明显降低。

12 病原学检查 分离培养与鉴定： 1）取骨髓液（由于该患者已经接受抗菌药物治疗而且血培养阴性，估取骨髓液最合适）后划种于血琼脂平板。
2）取粪便和经离心的尿沉淀物或玫瑰疹刮取物等直接接种于肠道鉴别培养基或SS选择培养基。37度孵育24小时后，挑取无色半透明的乳糖不发酵菌落接种至双糖或三糖铁培养基。 （若显微镜下细菌有周鞭毛，无荚膜芽孢，疑为沙门菌，再用沙门菌多价抗血清作玻片凝集试验予以确认。）

13 注意 若无法取粪便时可用肛拭子检查（用无菌棉拭子浸润生理盐水后，插入肛门4～5cm处轻轻沿肛避擦拭一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检）

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15 ps: SS琼脂平板是一种鉴别选择培养基，用来从临床样品，食品等中分离沙门氏菌和某些志贺氏杆菌。由于灿烂绿，胆盐，硫代硫酸盐，柠檬酸盐这些选择性抑制组分的影响，革兰氏 ( 染色 ) 阳性菌和大肠杆菌是不活跃的。可供沙门菌属和志贺菌属的分离培养用。

16 3）血清学试验协助诊断：除了前述病例里用过的肥达反应，还可用间接凝血法，ELISA法等，但其中肥达试验比较普及。

17 4、两次肥达反应的结果说明了什么？ 该患者除做肥达反应，还可作何检查？

18 肥达氏试验 1.肥达氏试验 伤寒血清凝集试验即肥达反应阳性者对伤寒，副伤寒有辅助诊断价值。检查中所用的抗原有伤寒杆菌菌体（o）抗原，鞭毛（h）抗原，副伤寒甲，乙，丙鞭毛抗原共5种，目的在于用凝集法测定病人血清中各种抗体的凝集效价。病程第1周阳性反应不多，一般从第2周开始阳性率逐渐增高，至第4周可达90%，病愈后阳性反应可持续数月之久。有少数病人抗体很迟才升高，甚至整个病程抗体效价很低（14.4%)或阴性（7.8%～10%），故不能据此而排除本病。

19 血清的凝集效价 血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。一般认为，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80以上，“H”抗体在1：160以上，甲、乙型副伤寒沙门菌凝集效价在1：80以上才有诊断价值。

20 1）两次肥达反应的结果说明了什么？ 第一次肥达反应结果：TO 1:160, TH 1:80, PA 1:20, PB 1:20.
第一次，该患者O抗体阳性, 说明该患者身上已经存在O抗原，可能感染了伤寒杆菌，而TH,PA,PB都没达到效价值，O高H不高可能是感染早期，或者也可能与伤寒沙菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌感染；或可能是由于患者早期用过抗生素治疗或其免疫功能低下等所致。 第二次，该患者O抗体和H抗体都呈阳性，并且是第一次的四倍以上,PA,PB没改变。从而说明该患者确实感染了伤寒杆菌而不是副伤寒，随着治疗的进行，在抗原的刺激下，患者O，H体内的抗体大幅增多，提示该患者进入恢复期。

21 2）其他免疫学检查 （1）被动血凝试验（pha）：用伤寒杆菌菌体抗原致敏红细胞，使之与被检血清反应，根据红细胞凝集状况判断有无伤寒特异性抗体存在，国内外报道阳性率90%～98.35%，假阳性率5%左右。鲍行豪等曾报道lsp-pha对伤寒血培养患者的检出率为89.66%，早期病人90.02%，临床确诊者为82.5%，且主要检测的是特异igm抗体，故可用于早期诊断。 （2）对流免疫电泳（cie）：本方法可用于血清中可溶性伤寒抗原或抗体的检测，操作简便，便于基层推广，特异性较高；但敏感性较低，不同作者报道为24%～92%，主要受采集血清时间的影响，发病初期最易测出，故可用于伤寒的早期诊断。

22 （3）协同凝集试验（coa）：利用金葡菌的葡萄球菌a蛋白（spa）可与抗体igg的fc段结合的原理，先用伤寒抗体致敏带有spa的金葡菌，然后与抗原发生反应，本试验的阳性率在81%～92.5%，特异性为94%～98%，一般来说，其敏感性高于cie，而特异性较cie差。 （4）免疫荧光试验（ift）：doshi等用伤寒杆菌菌体vi悬液作抗原进行间接免疫荧光抗体检测，140例血培养阳性的伤寒患者134例（95.7%）阳性；394例对照者仅4例（1%）假阳性，目前有关本法的报道尚少，伤寒疫苗预防接种和其它沙门氏菌感染是否会影响本试验特异性，尚需进一步研究。 （5）酶联免疫吸附试验（elisa）：elisa的基本原理是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，既可检测抗原，又可检测抗体，用elisa法检测伤寒患者vi抗原，灵敏性达1ng/ml，高于coa法9100ng/ml，并可检测到1∶1024稀释后尿液中的vi抗原。国内、外用elisa检测过临床标本中的vi抗原，v9抗原，lps，h抗原等，敏感性在62.5%～93.1%，因检测抗原的不同而异，多数在80%以上。杭州鲍行豪等应用elisa同时检测igm和igg抗体，lps-igm-elisa的敏感性为91.38%，特异性为99.02%，lps-igg-elisa分别为93.1%和98.02%，在伤寒的血清免疫学诊断方法中，elisa方法简便，快速，敏感，特异性高，是公认较好的一种诊断方法。

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24 分子生物学诊断方法 1.dna探针（dna probe） dna探针是用dna制备的诊断试剂，用于检测或鉴定特定的细菌，方法是用一段已标记的特定的dna片段（探针）与标本中已变性的细菌dna杂交，通过测定是否发生杂交反应来达到检测目的，由于此探针是以细菌专有的特异性基因片断制备，故特异性很高。用dna探针对培养所得的伤寒杆菌进行检测，敏感性需标本中达1000个细菌才能检出。dna probe的特异性高而敏感性低，一般用于菌种鉴定及分离。 2.聚合酶链反应（pcr） pcr方法是80年代中后期发展起来的一种分子生物学方法，它能在数小时内在体外将目标基因或dna片段扩增到数百万倍，检出率较dna探针高100～10000倍，国外jae hs等用pcr方法扩增伤寒的鞭毛抗原编码基因，敏感度能检出10个伤寒菌，特异性为100%，pcr方法因其高度敏感，易出现产物污染，所以控制pcr方法的假阳性及假阴性，是提高准确度的关键。